【摘要】 目的：测定铜绿假单胞菌对头孢噻肟的耐药性。方法：采用琼脂二倍稀释法测定铜铝假单胞菌对头孢噻肟的mic值。用铜绿假单胞菌 atcc27853标准菌株作为质控标准。按照美国临床实验标准委员会（nccls）2004年颁布的标准操作和判定结果。结果：铜绿假单胞菌对头孢噻肟的耐药率为59.18%。结论：临床分离的铜绿假单胞菌对头孢噻肟高度耐药，应考虑通过进行细菌培养和药敏试验，合理选用抗生素，或选用有协同作用的二联疗法来提高抗铜绿假单胞菌感染的疗效。
【关键词】 铜绿假单胞菌；头孢噻肟；耐药性
铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa) 是氧化酶阳性的非发酵革兰阴性杆菌,是临床最常见的条件致病菌。随着抗生素及某些医疗技术在临床的广泛应用,临床抗生素的预防用药和不合理应用,该菌耐药性日趋严重[1]。而头孢噻肟（cefetaxime）属第三代头孢菌素,具有广谱、低毒、高效、耐酶等特点，对革兰氏阴性菌有较强的抗菌作用。但随着该药的广泛使用,耐药菌与日俱增。为研究铜绿假单胞菌对头孢噻肟的耐药性，以便为临床合理使用抗生素提供参考，现测定我院临床分离的49株铜绿假单胞菌对头孢噻肟的的最小抑菌浓度(mic)，分析其对头孢噻肟的耐药性。
1 材料与方法
1.1材料
菌株：本实验所选用的49株铜绿假单胞菌均来源于四川大学华西医院实验医学科临床微生物室，均去除了同一病人的重复菌株。操作严格按照《全国临床检验操作规程》进行。其中44株来源于痰，2株来源于全血，1株来源于脓液，1株来源于分泌物，1株来源于咽拭子。质控菌株为铜绿假单胞菌 atcc27853；药物：注射用头孢噻肟钠（cefetaxime，ctx），规格为1.0 g/瓶，批号20020901，为哈尔滨誉衡药业有限公司产品。其他实验试剂由本室提供；mh培养基：为sigma公司产品（牛肉浸膏3 g，可溶性淀粉1.5 g，酪蛋白水解物17.5 g，蒸馏水1 000 ml，置于沸水浴混匀，调ph至7.4，置于103.43 kpa高压灭菌15 min）；实验器材及仪器：超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司产品；隔水式电热恒温培养箱：上海市跃进医疗器械一厂产品。其他实验器材均由本室提供。
1.2方法
采用琼脂二倍稀释法[2]。取9个培养皿，编号19，除1号外其余均加入mh培养基2 ml，然后用mh肉汤稀释头孢噻肟钠原液至1024 μg/ml，分别在1号和2号培养皿中加入2 ml，2号培养皿混匀后吸出2 ml加到3号培养皿中，依次对倍稀释至9号培养皿，吸出2 ml弃去；待高温消毒后的mh琼脂培养基冷却至60 ℃后分别吸出18 ml加到19号培养皿中（药物：琼脂=1∶9），边加边摇晃培养皿，使药物和培养基充分混匀，冷却后备用。生长后的菌液用3～5 ml生理盐水校正浓度至0.5麦氏比浊浓度，大约为108cfu/ml，用mh培养基稀释1∶10（含菌量约为107cfu﹒ml-1），用微量加样枪依次从低浓度到高浓度加入2 μl的检测菌液。待菌液干后将培养皿倒置放入37℃恒温培养箱孵育过夜。结果判断：菌落生长被完全抑制的最低的头孢噻肟的药物浓度为该药对检测菌的mic值。质量控制：每个培养皿同时接种了标准菌株铜绿假单胞菌 atcc27853。若头孢噻肟对标准菌株的mic在质控允许范围内（根据nccls2004年颁布的标准），则证明此次结果准确可靠。若超过或低于一个稀释度以上时，结果无效，重新实验。
2 结果
表1 49株铜绿假单胞菌对头孢噻肟的耐药率表2 49株耐药的铜绿假单胞菌对头孢噻肟的耐药情
3 讨论
通过测定我院临床分离的49株铜绿假单胞菌对头孢噻肟(ctx)的的最小抑菌浓度(mic)，可以发现铜绿假单胞菌对头孢噻肟有较高的耐药率,同现有的许多报道一致，如芦杰等的报道显示，从吉林省两家医院2003 年和2004年分离出的278 株铜绿假单胞菌对头孢噻肟的耐药率为63%[3]；许宏涛等的报道显示，从卫生部北京医院分离出的963株铜绿假单胞菌对头孢噻肟的耐药率超过了90%[4]。铜绿假单胞菌不仅对头孢噻肟的耐药率高，其对第三代头孢菌素及氟喹诺酮类等抗生素的耐药率也不断增高，华西医院的杜晓青等的研究就显示铜绿假单胞对头孢噻肟、头孢曲松、亚胺培南、环丙沙星、庆大霉素有较高的耐药性[5]。近年来由铜绿假单胞菌引起的感染病例逐年增加，随着耐药菌与日俱增，临床上对铜绿假单胞菌的治疗，显得越来越棘手，而其耐药性的研究，则越来越重要。
铜绿假单胞菌广泛分布于自然界,如正常人的皮肤、肠道、呼吸道和医院病房、医疗器械等均有其分布，是临床上假单胞菌属中最常见的条件致病菌,机体免疫力低下时，该菌可引起皮肤化脓性感染、呼吸道感染、泌尿道感染、烧伤等, 亦可导致菌血症、脑膜炎等严重感染。由于铜绿假单胞菌结构上的特殊性和生物学特性,导致它对多种抗菌药物表现出天然的耐药,其耐药机理十分复杂:如①铜绿假单胞菌外膜通透性很低,该菌的lps分子有6～7条脂肪酸链相互共价连接,使得膜流动性非常低,对药物的屏障作用十分强，它的非特异性通透性仅为大肠杆菌的0.2 %-1 %；②铜绿假单胞菌与抗生素接触后,还可产生产生抗生素灭活酶或修饰酶。其中细菌产生β内酰胺酶是细菌耐药的最重要的机制之一，产酶菌通过对β内酰胺类抗生素的水解作用,使其能在有β内酰胺类抗生素存在的环境下生存；③降低抗生素作用位点的敏感性，铜绿假单胞菌通过改变抗菌药物的作用位点青霉素结合蛋白和dna拓扑异构酶ii的结构,对β内酰胺类和喹诺酮类抗生素产生耐药；④铜绿假单胞菌通过缺失典型的孔道蛋白(porin)而降低了抗生素的通透性,它的孔蛋白具有特殊性,在维持铜绿假单胞菌基本生理代谢的同时,即使小分子水溶性抗菌素通过孔道的速度依然很慢,因而铜绿假单胞菌具有天然的多重耐药性；⑤外排各种物质的复杂的主动排出系统，许多研究表明铜绿假单胞菌细胞膜上的许多蛋白的确具有将抗菌药物主动外排的作用,并与其细胞外膜的低通透性协同作用,导致铜绿假单胞菌固有多重耐药。铜绿假单胞菌细胞膜上的主动外排蛋白是导致铜绿假单胞菌对多种抗生素表现固有或获得性多重耐药的原因。这些蛋白包括:转运抗生素的内膜蛋白mexb、mexd、mexf或mexy;控制抗生素进出细胞的外膜通道蛋白oprm、oprj或oprn；连接膜与相关外排蛋白的膜连接蛋白mexa、mexc、mexe或mexx。铜绿假单胞菌细胞膜上的这些主动外排蛋白组成四类主动外排系统,即mexab oprm、mexcd oprj、mexef oprn和mexxy oprm；⑥铜绿假单胞菌生物被膜的形成严重影响抗生素的进入,降低抗生素进入该菌的有效浓度。细菌生物膜是由细菌和它所分泌的胞外多聚物组成的外观呈膜状的多菌集合体(community),是细菌在生长过程中,为了适应生存环境而形成的一种与游走细胞相对应的存在形式,它具有极强的耐药性和抵抗机体免疫系统作用的能力。细菌生物膜表现出的这种极强耐药性的机理目前还不十分清楚,有渗透限制、营养限制和表型推断三种学说，而铜绿假单胞菌极易形成生物膜等[3][6]。
头孢菌素类抗生素是在头孢菌素母核7氨基头孢烷酸（7aca）基础上用化学方法连接不同的侧链而成的半合成抗生素，母核中一个环是六元双氢噻嗪环，另一个环是β内酰胺环，该环对抗菌活性起重要作用，所以铜绿假单胞菌产β内酰胺酶是该菌耐头孢菌素类抗生素的最重要的机制之一。谢芬[7]等研究的药敏试验结果显示，产β内酰胺酶的铜绿假单胞菌对试验所用的头孢菌素类抗生素的平均耐药率大大超过了非产酶的铜绿假单胞菌，其中产β内酰胺酶的铜绿假单胞菌对头孢噻肟的耐药率为66.67%，而非产酶的铜绿假单胞菌对头孢噻肟的耐药率为33.33%[7]。以上显示，产β内酰胺酶是我院临床分离的铜绿假单胞菌耐头孢菌素类抗生素的重要原因。
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