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赛莱西布对肝癌细胞增殖与凋亡影响

2022-11-05  本文已影响 445人 
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  摘要:目的探讨选择性环氧合酶-2(cox-2)抑制剂赛莱西布(celecoxib)对人肝癌细胞株hepg2细胞增殖、凋亡的影响及其可能的作用机制。方法用不同浓度的赛来西布处理hepg2细胞,分别应用四甲基偶氮噻唑蓝试验、dna梯度电泳法、放射免疫法检测赛亚西布对hepg2细胞增殖和凋亡及其cox-2活性的影响;应用免疫印迹法和比色法检测赛莱西布对hepg2细胞胱氨酸蛋白酶3(clasepase-3)蛋白质的表达及活性的影响。结果125,25,50μmol/l的赛莱西布作用于hepg2细胞后,hepg2细胞增殖受抑制,与对照组比较,差异有统计学意义(p<001);赛莱西布干预组hepg2细胞dna明显降解,可见细胞凋亡特征性梯状dna条带;干预组hepg2细胞caspase3蛋白表达及活性均明显升高,与对照组比较,差异均有统计学意义(p<001);赛莱西布明显抑制hepg2细胞cox-2活性,与对照组比较,差异有统计学意义(p<001)。结论赛莱西布可通过cox-2通路和caspase3通路抑制hepg2细胞增殖并诱导其凋亡。

  关键词:hepg2细胞;环氧合酶-2;赛莱西布;增殖;凋亡

  effectsofcyclooxygenase-2onproliferationandapoptosisinhepg2cells

  yuhongping,chouxiaoqiang,zengxiaoyun,etal.

  departmentofepidemiologyandstatistics,schoolofpublichealth,guangximedicaluniversity(nanning,530021,china)

  abstract:objectivetoexaminetheeffectsofaselectiveinhibitorofcox-2,owthwasmeasuredbymtt,apoptosiswasdetectedbydnafragmentationassay,andcox-2activitywasmeasuredbyria;expressionofcaspase-3proteininhepg2cellswasdeterminedbywesternblot,safterhepg2cellsweretreatedwithdifferentconcentrationsofcelecoxib(12.5,25,50μmol/l),celecoxibcouldsignificantlysuppressthegrowthofhepg2cellsrespectivelycomparedwiththecontrolgroup(p<0.01),andcelecoxib-treatedhepg2cellsproducedadistinctoligosomalladder,thecharacteristicsofcellsundergoingapoptosis;meanwhile,thecaspas-3expressionandactivityofcelecoxibtreatedhepg2cellswereincreasedrespectivelyascomparedwiththecontrolgroups(p<0.01).furthermore,thelevelofcox-2activitywasreducedincelecoxib-treatedhepg2cellsrespectivelycomparedwiththecontrolgroup(p<0.01).conclusioncelecoxibcouldinhibittheproliferationandincreaseapoptosisinhepg2cellsbycox-2andcaspase3pathways.

  keywords:hepg2cell;cyclooxygenase-2;celeeoxib;proliferation;apoptosis

  近年来的研究表明,环氧合酶-2(cox-2)在结直肠癌、食管癌、肺癌等多种人类肿瘤组织中高表达〔1-3〕。最新报道显示〔4,5〕,cox-2在肝癌组织中也高表达,并且在肝硬化组织中过表达,提示cox-2可能是肿瘤防治的一个新靶点〔3〕。非甾体类抗炎药(nonsteroidalanti-inflammatorydrugs,nsaids)具有预防和辅助治疗肿瘤尤其胃肠道肿瘤的作用〔6〕,但nsaids抑制肿瘤的作用机制尚不明确。本研究选择nsaids类药物中的1种高选择性cox-2抑制剂赛莱西布(赛来西布),作用于人肝癌细胞株hepg2观察其对hepg2细胞增殖与凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。结果报告如下。

  1材料与方法

  11材料

  111试剂赛莱西布(celecoxib,美国cayman公司);四甲基偶氮噻唑蓝(mtt,上海华美生物工程公司);二硫代苏糖醇(dtt,美国promega公司);兔抗aspase-3抗体、兔抗人cox-2多克隆抗体(美国santacruz公司);底物ac-devd-pna(n-acetyl-asp-glu-val-asp-p-nitroanilide)、核糖核酸酶-a(rnasea)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(hepes)、苯甲基磺酰氟(pmsf)、蛋白酶抑制剂(aprotinin,美国sigma公司),rmpi-1640培养基、小牛血清美国gibco公司);pge2放射免疫测定试剂盒(苏州大学医学院)。

  112仪器5415r低温台式高速离心机(德国eppendorf公司);hve50凝胶成像系统(美国syngene公司);gs-930薄层扫描图像分析仪(日本岛津公司);2123tc型co2培养箱(美国sheldon公司);elx800酶标仪(美国bio-tek公司)。

  12方法

  121细胞培养人肝肿瘤细胞株hepg2由广西医科大学实验中心保存。hepg2细胞为贴壁细胞,用含10%小牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的rpmi-1640培养基在37℃、饱和湿度及5%co2的细胞培养箱内传代培养。

  122mtt法测定赛莱西布对hepg2细胞增殖的影响用25g/l胰蛋白酶消化对数生长期的hepg2细胞制备单细胞悬液。以每孔5×103个细胞接种于96孔培养板,24h后换液,加入不同浓度赛莱西布使其终浓度分别为125,25,50μmol/l。设不进行药物干预的细胞为对照组。每种浓度平行4个复孔,继续培养。mtt法〔7〕测定赛莱西布对hepg2细胞增殖的影响。

  123dna梯度电泳法检测hepg2细胞凋亡dna片断

将1×106个细胞接种于100ml培养瓶,细胞贴壁后换液,加入赛莱西布使其终浓度分别为125,50μmol/l。设不进行药物干预的细胞为对照组。继续培养48h,提取细胞基因组dna,应用dna梯度电泳法〔7〕检测hepg2细胞凋亡dna片断。电泳结果用hve50凝胶成像系统观察、分析、拍照。

  124放射免疫法检测hepg2细胞cox-2活性前列腺素e2(pge2)是cox-2催化花生四烯酸产生前列腺素的主要产物,可用细胞分泌pge2的水平来反映cox-2的活性。因此,可采用赛莱西布对hepg2细胞分泌pge2的能力的影响来反它对cox-2活性的影响:以1×106/孔的密度将hepg2细胞接种于24孔板,24h后换培养基,设不进行药物干预的细胞为对照组,125,25,50μmol/l浓度的赛莱西布为干预组,每种浓度平行4复孔,继续培养24h后收集上清。按pge2放射免疫试剂盒说明测定pge2。

  125hepg2细胞caspase-3活性的测定以1×106个细胞接种于100ml培养瓶,细胞贴壁后换液,加入赛莱西布使其终浓度分别为125,25,50μmol/l。设不进行药物干预的细胞为对照组。继续培养24h后,收集漂浮和贴壁的细胞,并加入预冷的细胞裂解液[50mmol/l的tris-cl,200mmol/l的nacl,2mmol/l的乙二胺四乙酸二钠盐(edta),1%(v/v)tritonx-100、01mmol/l的pmsf],冰上孵育10min后,以15000r/min离心5min(4℃),取上清,并对其蛋白定量〔8〕。以细胞裂解液将待测样品蛋白浓度稀释至4g/l。反应体系含40μl待测样品、10μl的显色底物ac-devd-pna(20μmol/l)、50μl2×反应缓冲液[100mmol/l的hepes、2%(v/v)甘油、5mmol/l的dtt、05mmol/l的edta],37℃水浴中避光孵育2h以上,以el×800酶标仪在450nm波长处测定样品a值,以不加底物样本作空白比色。caspase-3活性直接以a值表示。同时在赛莱西布作用细胞前2h预加入ac-devd-cho,2h后再加入赛莱西布使其终浓度分别为125,25,50μmol/l,以下处理和检测同上。

  126westernblot检测hepg2细胞caspase-3蛋白质表达将1×106个细胞接种于100ml培养瓶,细胞贴壁后换液,加入不同浓度赛莱西布使其终浓度分别为125,25,50μmol/l。设不进行药物干预的细胞为对照组。继续培养48h后,用预冷的磷酸盐缓冲度(pbs)漂洗细胞,加入100μl预冷的细胞裂解液[50mmol/l的tris-cl,200mmol/l的nacl,2mmol/l的edta,1%(v/v)的tritonx-100、01mmol/l的pmsf],于冰上孵育20min后,15000r/min4℃离心5min,提取蛋白,并测定蛋白含量〔8〕。以细胞裂解液将待测样品蛋白浓度稀释至4g/l。蛋白印迹(westernblot)法〔8〕检测hepg2细胞caspase-3蛋白质表达。用dab显色试剂盒显色,检测杂交信号,岛津cs-930薄层扫描图像分析仪计算蛋白条带的积分a值。

  13统计分析应用spss100软件进行t检验。

  2结果

  21赛莱西布对hepg2细胞增殖的影响不同浓度赛莱西布作用于hepg2细胞72h后,125,25和50μmol/l干预组的a值分别为139±016,099±012,058±011,均显著低于与对照组a值243±026,差异有统计学意义(p<0001)。表明赛莱西布对hepg2细胞增殖有明显抑制作用,随着药物浓度增大,赛莱西布对hepg2细胞的增殖抑制作用更加明显。

  22赛莱西布对hepg2细胞凋亡的影响(图1)图1可见,对照组hepg2细胞dna电泳主要表现为靠近加样孔附近完整的基因组dna,而赛莱西布干预组hepg2细胞dna明显降解,可见细胞凋亡的特征性梯状dna条带。

  1:25μmol/l;2:空白对照;3:50μmol/l

  图1不同浓度赛莱西布干预处理48h对hepg2细胞凋亡影响(略)

  23赛莱西布对hepg2细胞caspase-3蛋白表达的影响westernblot检测结果显示,不同浓度的赛莱西布干预处理hepg2细胞48h,干预组hepg2细胞的capase-3的蛋白表达均明显升高,与对照组比较差异有统计学意义(p<001,图2,表1)。

  1:空白对照;2:12.5μmol/l;3:25μmol/l;4:50μmol/l

  图2赛莱西布对hepg2细胞caspase-3蛋白表达水平影响(略)

  表1赛莱西布对hepg2细胞caspase-3蛋白表达水平的影响(略)

  24赛莱西布对hepg2细胞caspase-3活性的影响125,25和50μmol/l干预组caspase-3活性分别为024±0013,044±0016,071±009,均高于与对照组caspase-3活性001±0012,差异有统计学意义(p<0001),表明赛莱西布可诱导hepg2细胞caspase-3活性的升高。进一步用caspase-3特异性抑制剂ac-devd-cho先于赛莱西布与细胞作用,2h后再加入赛莱西布作用24h,发现赛莱西布中ac-devd-chd处理组hepg2细胞caspase-3活性显著低于赛莱西布组,表明ac-devd-cho能抑制赛莱西布诱导hepg2细胞的凋亡。

  25赛莱西布对hepg2细胞cox-2活性的影响125,25和50μmol/l干预组前列腺素e2(pge2)水平(pg/(ml・106cells)分别为3610±435,2627±366和1765±273,均显著低于与对照组11228±871,差异有统计学意义(p<0001),表明赛莱西布可明显抑制hepg2细胞pge2释放水平。随着药物浓度的增加,pge2释放水平逐渐下降,表明赛莱西布可抑制hepg2细胞cox-2活性。

  3讨论

  本研究发现,用不同浓度赛莱西布作用于hepg2细胞后,对细胞生长增殖有明显抑制作用

,并且随着浓度的增大,这种抑制作用更明显,呈一定的剂量依赖关系。用dna梯度凝胶电泳法观察赛莱西布对hepg2细胞凋亡的影响,发现赛莱西布干预组的细胞基因组dna电泳表现为特征性的梯形条带,说明cox-2参与了hepg2细胞凋亡过程。放射免疫法检测显示,hepg2细胞培养上清中有pge2的释放,赛莱西布可明显抑制hepg2细胞pge2释放水平,减少pge2产生。而pge2是cox-2催化花生四烯酸产生pgs的主要产物,说明赛莱西布可能通过抑制cox-2酶催化活性而减少pge2产生,从而抑制hepg2细胞增殖,诱导其凋亡。本研究发现,赛莱西布以剂量依赖性方式诱导hepg2细胞caspase-3蛋白表达水平显著增加,其活性也明显升高,提示caspase-3活化介导了赛莱西布诱导的hepg2细胞凋亡。为进一步证实上述结论的可靠性,本研究用caspase-3特异性抑制剂ac-devd-cho预先作用于hepg2细胞,再施以赛莱西布干预。结果显示,当封闭caspase-3的裂解激活,相同浓度赛莱西布诱导的hepg2细胞凋亡明显受到抑制。提示赛莱西布可通过激活caspase-3而诱导肿瘤细胞凋亡。本研究结果显示,赛莱西布可通过cox-2通路和caspase-3通路抑制hepg2细胞增殖并诱导其凋亡。最近,ferrandina〔9〕等对14例患有头颈部癌的病人给予短时期的赛莱西布处理后,病人平均cox-2表达水平显著降低,ki67明显下降,肿瘤组织微血管密度值明显降低。结合本研究结果,提示选择性cox-2抑制剂是一种有应用前景的肝癌预防和治疗的化学药物。

  参考文献

  〔1〕zhas,yegnasubramaniavv,nelsonwg,xygenasesincancer,progressandperspective[j].cancerlett,2004,215(1):1-20.

  〔2〕yuhp,xusq,liul,xygenoase-2expressioninsquamousdysplasiaandsquamouscellcarcincmaoftheesophagus[j].cancerlett,2003,198(2):193-201.
  
  〔3〕高雪芹,张维东.cox-2在肿瘤组织的表达及其化学预防靶点的意义[j].

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