[摘要] 目的 观察复方松及片（CFRB）对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响，初步探究复方松及片对肺纤维化的作用及其机制。 方法 采用气道滴入博莱霉素（2.5 mg/kg）制备肺纤维化模型，在造模后每日采用灌胃方式给予复方松及片提取物，对照组腹腔注射地塞米松。连续用药14 d后，采用生理盐水进行支气管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），收集BALF，ELISA法测定转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的含量。液氮速冻肺组织，-80℃保存，检测各组肺组织羟脯氨酸含量，以及PDE8A mRNA的表达。 结果 复方松及片提取物对博莱霉素气道滴入诱导的肺纤维化变化有一定的抑制作用，能改善肺组织的纤维化病理改变。复方松及片提取物能明显降低BALF中TGF-β的含量，且对磷酸二酯酶8A（PDE8A）的mRNA表达也有一定的抑制作用。 结论 复方松及片对博莱霉素诱导的肺纤维化有一定作用，提示复方松及片可能用于肺纤维化的治疗，同时PDE8A可能是肺纤维化的新靶点。
[关键词] 复方松及片；肺纤维化；博莱霉素；磷酸二酯酶8A
[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）10（a）-0024-04
特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种原因不明、与年龄相关的破坏性肺部疾病，以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱导致肺间质纤维化为特征，通常这种实质病变具有不可逆性及严重的致死率[1]。目前尚无有效的治疗手段来阻止或逆转纤维化的过程，因此寻找可以在上皮损伤过度修复过程中发挥作用的药物，成为探索终止和逆转肺纤维化过程的关键。
复方松芨片（Compound Formula Rosin and Bletilla Table，CFRB）的主要成分是白及（Bletillae Rhizoma）、沙参（Fourleaf Ladybell Root，Radix Adenophorae）、百部（Stemona Root，Radix Stemonae）等，这些成分均归肺经，具清肺、化痰、止咳、扶正抗痨、止血生肌等功能，临床上主要用于各型结核病出血、慢性咳喘及慢性胃肠疾病等，临床效果显著。有文献报道白及对矽肺肺部症状有改善作用[2]，而沙参对博莱霉素诱导的肺纤维化有改善作用[3-5]，但作用尚不清楚。本研究采用博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型，研究CFRB对肺纤维化病理改变的影响，进一步检测代表性的炎症因子如TGF-β1的分泌，肺组织中羟脯氨酸的含量等，并从mRNA表达水平进行了相关机制研究，为临床治疗肺纤维化提供新途径，为老药新用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物、药品、试剂和仪器
ICR小鼠，雄性，8周，体重在20～22 g，由浙江大学动物实验中心提供，动物合格证号：2007000526749。动物饲养及操作过程均遵守浙江大学《实验动物管理条例》要求。
博莱霉素（Sigma公司，批号：9041-93-4），复方松及片（京山中医院，批号：20100501），地塞米松磷酸钠注射液（浙江省仙琚制药股份公司）。
Real time PCR相关试剂[包括dNTP Mixture，Oligo（dt）18 primer，RNase Inhibitor，M-MLV Reverse Transcriptase，宝生物工程（大连）有限公司]，羟脯氨酸测定试剂盒（凯基，KGT030-2），小鼠TGF-β1 ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），小鼠β-actin、PDE8A引物（由上海生工生物工程有限公司合成）。
PCR仪（Eppendoff公司），水平电泳仪（英国CLP公司）。
1.2 模型建立与实验分组
根据本实验室建立的小鼠肺纤维化造模方法，对小鼠进行4%水合氯醛麻醉（280 mg/kg），然后有创气道给药法滴入生理盐水配制的博莱霉素（2.5 g/L），剂量为2.5 mg/kg，地塞米松组腹腔注射地塞米松2.0 mg/kg，正常组滴入同等体积的生理盐水。
CFRB提取液配制方法：将片剂粉碎研磨后称重，5倍重量的蒸馏水浸泡过夜，5 000 g离心取上清，然后70℃水浴浓缩至1 g/mL浓度，依次稀释成0.20、0.04 g/mL。灌胃给药剂量分别为低剂量0.4 g/kg、中剂量2.0 g/kg、高剂量10.0 g/kg，博莱霉素气道滴入后即开始给药，博莱霉素给药后14 d处理，半侧肺进行支气管肺泡灌洗及留取另半侧肺组织进行病理学、蛋白及分子生物学检测等。
1.3 肺组织病理学观察
小鼠股动脉放血处死后，留取肺组织用10%福尔马林溶液固定，制备石蜡切片，作病理检查，进行Masson染色，观察肺组织纤维化改变，Masson染色组织切片上蓝染色的为胶原蛋白。
1.4 肺组织中羟脯氨酸含量测定
取右肺称重，加入1 mL水解液匀浆后100℃水浴（电磁炉保温档）水解20 min，调pH值至6.0～6.8，然后加入蒸馏水10 mL，混匀，3 500 r/min离心10 min，取1 mL上清，60℃水浴15 min，冷却后，550 nm波长读取数值。计算公式：
羟脯氨酸含量（μg/mL） = （测定管吸光度-对照管吸光度）/（标准管吸光度-空白管吸光度）× 标准管含量（μg/mL）×[水解总体积（mL）/取样量（mL）]
1.5 BALF 中转化生长因子-β1（TGF-β1）的ELISA测定
取1 mL生理盐水灌洗肺组织得到肺泡灌洗液。以2 000 r/min离心10 min，留取上清液。按照说明书进行TGF-β1的ELISA含量测定。
1.6 Real time -PCR测定肺组织中磷酸二酯酶8A的mRNA的表达
取液氮固定的左肺组织加入1 mL Trizol于冰浴中匀浆，提取RNA，逆转录合成cDNA，于-20℃保存。以cDNA为模板，用目的基因PDE8引物进行定量PCR扩增，内参为β-actin。引物序列如下：小鼠β-actin上游（5'-3'）：GAT TAC TGC TCT GGC TCC TAG C；小鼠β-actin下游（5'-3'）：GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG C。扩增条件为：95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，25个循环。小鼠PDE8A上游（5'-3'）：CCA TCA CCA AGG TAA TCA；小鼠PDE8A下游（5'-3'）：TCC GTG GTG GGA CAT CAT。扩增条件为：95℃ 10 s，48.9℃ 30 s，72℃ 45 s，40个循环。
1.7 统计学方法
采用SPSS 10.0统计软件进行数据分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CFRB提取物对博莱霉素诱导肺组织纤维化的病理变化的影响
博莱霉素气道滴入后14 d，成功诱导了肺组织纤维化病变。Masson染色呈蓝色的即沉积的胶原纤维。模型组气道附近胶原沉积明显，肺泡组织结构被严重破坏，间隔消失形成空洞。正常组的肺组织肺泡结构清晰且完整，无炎症细胞浸润。而地塞米松组对抗博莱霉素诱导的肺纤维化病变作用不明显。CFRB提取物对此纤维化病变的抑制作用呈现出剂量依赖性，低剂量组效果不明显，高剂量对此纤维化有明显抑制作用。见图1。
2.2 CFRB提取物对博莱霉素诱导纤维化肺组织羟脯氨酸含量的影响
肺组织中羟脯氨酸含量在博莱霉素气道滴入后14 d即快速上升，与正常组比较差异有高度统计学意义（P < 0.01）。地塞米松组羟脯氨酸含量有抑制趋势，但与模型组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。低、中剂量CFRB提取物对羟脯氨酸的影响也不明显，但高剂量组下降较明显，与模型组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。
2.3 CFRB提取物对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠BALF 中TGF-β1含量的影响
在博莱霉素刺激后14 d，TGF-β1上升迅速，达325 pg/mL，明显高于正常对照组（P < 0.001）。而CFRB提取物各剂量对TGF-β1的分泌较均模型组有明显抑制作用，尤以高剂量组为显著（P < 0.001）。而地塞米松组较模型组也能明显抑制TGF-β1的分泌（P < 0.001）。
2.4 CFRB提取物对博莱霉素诱导纤维化肺组织中PDE8A mRNA表达的影响
根据定量PCR结果，博莱霉素刺激后肺组织中PDE8A的mRNA表达量明显增加，这与肺纤维化的趋势相符。与正常组比较，14 d的PDE8A mRNA表达差异有高度统计学意义（P < 0.01），相对表达量比值为0.49；CFRB提取物各剂量组PDE8A mRNA的相对表达量与模型组比较均有明显下降（P < 0.05或P < 0.01）。地塞米松组PDE8A的表达也有下降，但差异无统计学意义（P > 0.05）。
3 讨论
复方松及片里的成分较多，主要成分白及，具有止血生肌、化痰敛肺的作用。临床多用于大咯血、肺结核少量咯血等的治疗，效果较显著[6-7]。白及水提物中的主成分为白及多糖[8-9]，有研究表明其具有抗菌[10]、抗氧化[11]、抑制大鼠皮肤成纤维细胞VEGF的mRNA表达[12]等作用。中药治疗矽肺的记载中提及白及对矽肺症状有治疗作用，但对X光胸片无改善[2]。沙参具有祛痰作用，有研究报道其对博莱霉素诱导的实验性肺纤维化有明显改善作用[3]，能降低肺组织纤维连接素、层粘蛋白的含量[4]。对博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠也有明显改善作用，能降低肺组织羟脯氨酸含量[5]。百部生物碱具有止咳、化痰、平喘、抗菌等作用[13]。Liao等[14]研究发现百部水提取物对Carbacol、组织胺、Kcl所致的离体豚鼠支气管平滑肌痉挛有松弛作用。
磷酸二酯酶（phosphodiesterases，PDEs）是细胞内第二信使cAMP和cGMP的水解酶，负责维持细胞内第二信使浓度平衡，在信号传递过程中扮演着重要作用。PDEs作为一个有11个家族成员的蛋白酶超家族，拥有非常多的变异体。最近的研究表明PDE8家族是保持cAMP稳态的调节者之一，在淋巴细胞中高表达，提示其在调节免疫和炎症中起作用，但目前对其抗炎作用的研究尚无。目前已知哺乳动物PDE8家族包括2个基因PDE8A、PDE8B。两种异构体都对cAMP有特异性且对底物有着很高的亲和力。PDE8A mRNA的表达十分广泛并在许多组织被检测到，PDE8已被证实与淋巴细胞趋化相关，通过干预淋巴细胞内cAMP信号通路可以阻止淋巴细胞透过毛细血管向炎症病灶区聚集。抑制剂实验证明抑制PDE8可以弥补单独抑制PDE4的不足，阻止炎症病灶区对淋巴细胞的募集作用[15]。
博莱霉素诱导的纤维化与IPF的病理生理相似，是目前应用最广泛的肺纤维化模型，用药后14～28 d形成肺纤维化[16]。最近有研究报道PDE亚型抑制剂如PDE4抑制剂-罗氟司特和西洛司特、PDE5抑制剂-西地那非等均对博莱霉素诱导的肺纤维化动物模型有作用[17-19]。而PDE8目前功能尚不清楚。笔者研究发现，博莱霉素刺激14 d肺泡炎症细胞浸润，大量巨噬细胞，淋巴细胞聚集并释放到肺泡腔，胶原沉积于肺泡间质，表明本实验肺纤维化模型制备成功。在这个过程中大量的信号因子被释放出来，诱导肺泡上皮细胞的迁移与增殖如TGF-β1。TGF-β1是主要导致纤维化的细胞因子，可直接作用于成纤维细胞，主要由巨噬细胞分泌[20]。笔者在研究中发现PDE8A在博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型上表达上调，同时发现了CFRB的粗提物对其有效，检测代表性的炎症因子如TGF-β1等的分泌及羟脯氨酸含量等指标，结果均提示CFRB能有效对抗博莱霉素诱导的肺纤维化改变。笔者将上述结果中的TGF-β1含量与PDE8A mRNA表达进行了相关分析，结果显示TGF-β1含量的变化趋势与PDE8A mRNA表达量间的相关系数为0.541（P < 0.05）。提示PDE8A与肺纤维化间存在相关性，提示PDE8A可能是CFRB的作用靶点，也提示PDE8A可能是肺纤维化的治疗靶点。
综上所述，CFRB提取物能有效对抗肺纤维化病变，其机制涉及PDE8A亚型在博莱霉素诱导的小鼠纤维化肺组织中高表达，提示CFRB可能成为肺纤维化治疗药物，同时PDE8A可能是一个较好的抗肺纤维化药物的研究靶点。
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