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减毒麻疹病毒诱导子宫内膜腺癌细胞凋亡的策略是(减毒麻疹病毒诱导子宫内膜腺癌细胞凋亡的策略包括)

2022-11-09  本文已影响 521人 
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 子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤,以来源于内膜腺体的腺癌最常见。为女性生殖道三大恶性肿瘤之一,占女性生殖道恶性肿瘤的20%~30%。近年来发病率在世界范围内呈上升趋势。早期患者预后较好,而晚期患者多有盆腔外转移,预后差,虽然采用手术、放射、药物等综合治疗,但5年生存率仍较低,因此寻找新的治疗方法迫在眉睫 [1]。溶瘤病毒治疗是近年来兴起的一种新的肿瘤治疗途径,其机制在于利用基因工程对病毒进行改造,使其在肿瘤中选择性复制并产生溶瘤作用[2]。病毒溶瘤结合其他治疗,使得肿瘤治疗的疗效显著提高,得到我国政府的重视,不断加大投入,相继启动了一些与溶瘤病毒学密切相关的重大研究项目。麻疹病毒(MV)感染可诱导多种细胞凋亡,利用MV这一感染特性,有研究人员开展了利用MV治疗淋巴瘤、脑肿瘤、卵巢癌等的研究,并获得了较好的疗效[3-7]。尤其是利用基因重组的MV-CEA、MV-NIS(MV与放射性碘化钠的重组体)治疗卵巢癌的方法已用于一期临床试验[6-7]。JEC是一株人子宫内膜腺癌细胞系,研究证实子宫内膜腺癌细胞表面表达麻疹病毒结合受体CD46[8]。因此设想麻疹病毒是否对子宫内膜腺癌有抑制作用;其抑制作用是否通过诱导细胞凋亡实现?因此,本实验通过不同浓度的MV感染JEC细胞,然后观察不同感染浓度及时间细胞的增值及凋亡情况,并对病毒感染前后细胞Fas、FasL、TGF-β的表达进行测定,初步探讨MV对JEC的抑制作用及其相关机理,为利用MV对子宫内膜癌进行溶瘤治疗的进一步研究提供实验依据。
  1 材料与方法
  1.1 材料 麻疹病毒疫苗京160(北京天坛生物制品股份有限公司);JEC细胞(遵义医学院微生物教研室);Annexin-v FITC/PI试剂盒(晶美生物工程公司);兔抗Fas、兔抗FasL、兔抗TGF-β(Santa Cruz公司);小量凋亡DNA抽提试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)。
  1.2 方法
  1.2.1 病毒感染浓度的选定 TCID50测定按照中国生物制品规程操作,对病毒进行倍比稀释,接种JEC细胞,每个稀释度设4复孔,并设空白对照,置37 ℃、相对湿度97%、5% CO2孵箱中连续培养,观察7 d,以第7天感染细胞出现2孔或2孔以上多核巨细胞病变的病毒的最高稀释度作为病毒效价。
  1.2.2 MTT检测 用96孔板接种细胞,待细胞贴壁伸展生长后,MV感染细胞,每个稀释度设6复孔,并设正常对照。感染后第1~10天分别进行MTT检测。
  1.2.3 琼脂糖凝胶电泳 按DNA提取试剂盒说明书提取经病毒感染12 d(根据预实验结果)的JEC细胞DNA,进行2%琼脂糖凝胶电泳,条件为60 V,4 h,然后使用凝胶成像分析系统检测电泳结果并拍照。
  1.2.4 流式细胞术 于病毒感染后一定时间收集细胞,按Annexin-V FITC/PI试剂盒说明书进行操作,制备样品,上机检测细胞凋亡率。
  1.2.5 免疫细胞化学法检测细胞凋亡机理 收集MV感染后12 d的细胞,进行石蜡包埋、切片,进行切片的免疫组化实验,观察细胞Fas、FasL以及TGF-β的表达变化,进行吸光度值的比较。设阴性对照、正常对照、病毒组。
  1.3 统计学处理 采用SPSS 12.0软件对所得数据进行统计分析,两变量的相关性以相关系数(r)值确定,计量资料用(x±s)表示,比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
  2 结果
  2.1 病毒TCID50 病毒TCID50的稀释度为1:160,本研究拟采用1:80、1:40、1:20、1:10四个稀释度作为感染浓度。
  2.2 MTT检测 抑制率=1-(病毒组OD/正常对照组OD),见表1。每个稀释度设6复孔,同一感染浓度条件下,病毒感染时间与抑制率呈正相关(P<0.01)。感染后6 d内,病毒对细胞的生长表现为促进作用;而6 d后,开始出现抑制作用,同一感染浓度,各浓度组不同感染天数的组间均存在着差异(P<0.05或P<0.01),9、10 d抑制率与感染浓度呈正相关
  2.3 凋亡特征性 DNA “Ladder”条带的形成在1:10、1:20、1:40稀释度出现了凋亡特征性的“Ladder”条带,而对照组无明显的DNA“Ladder”条带的出现,见图1。
  图1 MV感染后JEC细胞DNA电泳结果
  注:M:marker;1:阴性对照;2~4:1:10、1:20、1:40稀释度感染12 d
  2.4 流式细胞仪检测JEC凋亡率的结果 每个稀释度设3复瓶培养,同一感染浓度条件下,随感染时间的延长,细胞凋亡率逐渐上升,两者为正相关。同一时间点与对照组比较,病毒组的细胞凋亡率升高(P<0.05或P<0.01),感染后12 d,感染浓度与凋亡率呈正相关,见表2。
 2.5 免疫细胞化学法检测JEC细胞Fas、FasL以及TGF-β表达结果
  2.5.1 Fas的表达 镜下Fas阳性染色主要位于细胞浆中,每组取8个不同视野进行光密度值测定,与正常对照组相比,病毒组Fas阳性反应强度增加,染色变深;正常对照组与阴性对照组相比,染色变深。经图像分析系统软件分析各组的平均吸光度值,结果显示与阴性对照组相比,正常对照、病毒组的平均光密度值降低。各组间比较差异显著(P<0.01),见表3。
  2.5.2 FasL的表达 每组取8个不同视野进行光密度值测定,镜下观察FasL在阴性对照组、正常对照组、病毒感染组中均无表达。比较各组平均光密度值,各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。
  2.5.3 TGF-β的表达 每组取8个不同视野进行光密度值测定,镜下阴性对照组、正常对照组均不表达,病毒组阳性染色主要位于细胞浆内,经图像分析系统软件分析各组的平均光密度值。结果显示:与阴性对照组比较,正常对照组光密度值降低不明显,组间差异无统计学意义(P>0.05);病毒组与上述两组相比平均光密度降低,组间比较差异有显著统计学意义(P<0.01)。
  3 讨论
  MV为单股负链RNA病毒,H、F和N(核蛋白)三种蛋白是麻疹病毒的主要抗原成分,MV通过CD46、SLAM(淋巴活化信号分子)、DC-SIGN(C-血凝素细胞间粘附分子)受体介导病毒的感染及传播,CD46是麻疹疫苗株和麻疹病毒实验室株的主要细胞受体[9-12]。SLAM在有活性的T 和B细胞表面上表达,是新发现的麻疹病毒细胞受体[13]。麻疹野生病毒、实验室株和麻疹疫苗株都能在有表达SLAM的细胞上产生典型的病变,诱导细胞凋亡,因此MV在人类肿瘤的溶瘤治疗中具有广泛的应用前景,其抗瘤谱包括多种淋巴、非淋巴人类恶性肿瘤。在妇科肿瘤中,国外已经将基因改造的MV应用于卵巢癌的I期临床试验[6-7]。国内亦有研究证实麻疹减毒活疫苗体外可抑制原代卵巢癌细胞生长,引起细胞病变和细胞凋亡,另有研究显示MV减毒株在组织培养中和裸鼠体内对HeLa人宫颈癌肿瘤有明显的杀伤作用,因此减毒MV疫苗株在妇科肿瘤中有很好的应用前景[14-15]。本研究将减毒麻疹疫苗感染人子宫内膜腺癌细胞,感染后6 d,亦表现为抑制细胞的生长,并诱导细胞凋亡,且细胞凋亡率与病毒的感染时间及感染浓度有关,由此,笔者推测MV抑制细胞生长可能是通过诱导细胞凋亡实现的。但是,在病毒感染6 d内,病毒对细胞的生长表现为促进作用,病毒浓度越高,其促进作用越强。推测其可能的原因是细胞感染早期,无细胞膜及线粒体膜的破裂,细胞相互融合,使线粒体的功能加强,还原MTT形成蓝紫色的甲臢结晶增多,导致OD值升高;也可能是MV感染初期细胞分泌促生长物质,使细胞生长加快。但这种推测,还有待进一步实验证明。总之,MV最终抑制JEC的生长,并诱导感染细胞的凋亡,可进一步用于人子宫内膜腺癌治疗的实验研究。
  通过MV感染DC细胞的研究证明,人类DC细胞的凋亡是通过Fas/FasL介导[16]。另外,MV可通过诱导体外培养的外周血单核细胞(PBMC)Fas的表达,间接引起未感染MV但表达FasL的旁观者T细胞凋亡[17]。TGF-β既能增强某些细胞的增殖、分化能力,又能诱导某些细胞的凋亡反应,如TGF-β可诱导淋巴细胞、肝细胞、肝癌细胞、子宫上皮细胞凋亡及猴免疫缺陷病毒感染所致的B细胞淋巴瘤细胞的凋亡[18]。病毒感染可使TGF-β的表达增加,活性增强,促进凋亡的发生。实验结果显示,MV感染后12 d,各组细胞的凋亡率增至最高,并出现DNA Ladder凋亡条带,此时病毒组Fas、TGF-β的表达均增加,而FasL在正常对照及病毒感染组始终未表达。提示MV诱导JEC凋亡的机制可能与Fas及TGF-β的表达有一定的关系,但FasL不表达的原因仍有待今后进一步探讨。
  参考文献
  [1]万小平,蔡斌,刘玲,等.不同期别子宫内膜癌组织中差异表达基因的层次聚类分析[J].中华妇产科杂志,2006,41(1):38-42.
  .Mol Ther,2008,17(1):57-64.
  .Virology,2004,323(2):292-302.
  [4] Laine D,Bourhis J M,Longhi S,et s virus nucleoprotein induces cell- proliferation arrest and apoptosis through NTAIL-NR and NCORE-FcyRIIB1 interactions,respectively[J].J Gen Virol,2005,86(6):1771-1784.
  [5] Nakamura T,Russell S tic measles viruses for cancer therapy[J].Expert Opin Bio,2004,4(10):1685-1692.
  .Clin Cancer Res,2006,12(6):1868-1875.

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