TLR4是一种重要的模式识别受体，参与了机体针对多种病原体的天然免疫。早期研究认为TLR4主要是识别革兰阴性菌胞壁内毒素的主要成份脂多糖（LPS），随着研究的深入，人们发现TLR4还可以识别病毒蛋白，参与抗病毒免疫应答[1]。目前的研究已经显示，TLR4与HCV及HBV相互作用，促进病毒的复制与扩散，引起组织炎症，继而增加罹患肝纤维化/肝硬化的风险[2-7]。鼠肝炎病毒（MHV）是一种广泛存在的冠状病毒，可以在小鼠中引起病毒性肝炎，目前尚无研究报道MHV-3病毒蛋白可以与TLR4相互作用。本实验室采用3型鼠肝炎病毒（MHV-3）腹腔注射C3H/HeJ小鼠建立了肝炎病毒持续感染的模型[8]。C3H/HeJ小鼠的TLR4基因存在自发性突变，导致该小鼠TLR4缺陷而对LPS无反应[9-11]，但该小鼠其他遗传背景均与TLR4正常表达的C3H/HeN小鼠相同。本研究采 表1 小鼠感染MHV-3后临床症状评分 评分皮毛质地呼吸身体颤抖 5光泽柔顺约200次/min正常，无颤抖 4无光泽，较柔顺约230次/min身体略有颤抖 3无光泽，竖毛230~260次/min较明显颤抖，拱背，静止懒动 2竖毛，粘连超过260次/min较明显颤抖，拱背，爬行缓慢 1竖毛，粘连，潮湿超过260次/min，伴有胸腹部舒缩明显颤抖，拱背，基本不能行动 用C3H/HeJ及C3H/HeN两种亚系小鼠建立病毒性肝炎模型，观察并比较两种亚系小鼠的临床症状及存活情况，探讨TLR4对MHV-3诱导的C3H/He小鼠病毒性肝炎的影响。 1 材料与方法 1.1 实验动物 6~7周龄雌性C3H/HeJ 40只，购自北京华阜康动物生物科技股份有限公司，许可证号SCXK京2009-0004，6~7周龄雌性C3H/HeN 40只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK京2012-0001。所有小鼠饲养于IVC系统。在12/12h昼夜循环、恒温恒湿条件下自由摄取食水，饲养1周后开始试验。 1.2 病毒株 MHV-3为本研究室保存病毒株，在DBT细胞系空斑纯化后于鼠17CL1细胞系繁殖培养，鼠L2细胞系蚀斑纯化和滴度测定。本研究所用MHV-3滴度为1.0×106 PFU/mL。 1.3 动物模型的建立 随机取C3H/HeJ及C3H/HeN小鼠各30只，腹腔注射 100μL MHV-3（0.1 PFU/μL），另取C3H/HeJ及C3H/HeN小鼠各10只，注射100μL 无菌PBS作为对照。注射后的小鼠，继续饲养于IVC系统。在12/12h昼夜循环、恒温恒湿条件下自由摄取食水。 1.4 小鼠生存状态观察 每天观察小鼠生理状况及死亡情况，并对每只存活小鼠皮毛、呼吸及身体颤抖三项特征进行评分[12]。正常状态记为5分，状态明显异常记为1分，综合评分满分为15分，见表1。计算每组存活小鼠的平均得分，已死亡小鼠不参与计分。两组小鼠均观察至感染后40d。 1.5 统计学分析 应用Sigma Plot12.0统计软件包进行资料分析，临床症状评分采用重复测量数据的方差分析进行比较，生存率的比较采用Kaplan-Meier生存分析，P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 一般情况 C3H/HeJ及C3H/HeN小鼠均于感染后3d开始一般状态变差，精神萎靡，毛发无光泽，感染2周内，小鼠症状明显，可见毛发竖直粘连，呼吸加快，颤抖拱背，肢体无力，行动迟缓，并出现死亡，临床症状综合评分均出现明显下降，感染2周后临床症状开始缓解，小鼠状态均明显好转，感染3周后，存活小鼠状态基本恢复，综合评分接近正常水平，见图1。注射PBS的对照小鼠，均未出现临床症状。 采用重复测量数据的方差分析进行统计，小鼠品系因素对临床症状评分不起作用，临床评分有随时间变化的趋势，且时间因素的作用随小鼠品系而不同，见表2。C3H/HeJ小鼠在感染后第4天，临床症状评分为（13.267±2.791），较正常水平显著下降（P=0.014）；感染后第25天，临床症状综合评分（14.500±0.535），与正常水平无差异（P=0.077）。而C3H/HeN小鼠在感染后第5天，临床症状评分为（10.933±4.608），较正常水平显著下降 （P＜0.001）；感染后第22天，临床症状综合评分（14.429±0.535），与正常水平无差异（P=0.076）。在感染后第5、6、13天，C3H/HeJ小鼠综合评分依次为（13.071±1.184）、（8.321±5.048）、（13.091±1.578），C3H/HeN小鼠综合评分依次为（10.933±4.608）、（11.304±3.901）、（10.846±3.671），两亚系小鼠综合评分有统计学差异（P＜0.001，P＜0.001，P=0.015），其他时间点两亚系小鼠综合评分无显著差异。 图1 MHV-3 感染后C3H/HeJ及C3H/HeN小鼠临床症状综合评分 图中数据为各时间点存活小鼠皮毛、呼吸及身体颤抖三项指标综合评分的平均值。 表2 小鼠个体变异计算结果 Source of Variation DF SS MS F P Sub-strain10.8280.8280.1310.718 Days392195.62856.29815.987＜0.001 Sub-strain x days39236.5176.0651.7220.004 2.2 存活率及平均存活时间 C3H/HeJ及C3H/HeN小鼠分别于感染第4、5天开始出现死亡；感染5~6d为死亡高峰，两组小鼠均有近一半的死亡出现在这一段时期；在感染后12~14d，两组感染小鼠再次出现比较集中的死亡；感染20d后，小鼠状态基本[第一论文 网(. ) 专业提供论文写作和写作论文的服务,欢迎光临]稳定，至感染后40d未再出现死亡。C3H/HeJ及C3H/HeN小鼠存活率分别为26.7％和23.3％，平均存活时间（mean survival time， MST）分别为16.267d和16.433d，差异无统计学意义（P=0.922）。死亡情况及生存率曲线分别见表3及图2。注射PBS的对照小鼠，均未出现死亡。 表3 C3H/HeJ及C3H/HeN小鼠感染MHV-3后死亡情况 感染后 天数死亡数量（只） 存活概率（％） C3H/HeJC3H/HeN C3H/HeJC3H/HeN Day 42－ 93.9 － Day 5－7 －76.6 Day 6134 50.0 63.3 Day 82－ 43.3 － Day 9－1 －60.0 Day 10－1 －56.7 Day 11－1 －53.3 Day 1223 36.7 43.4 Day 13－2 －36.7 Day 1433 26.7 26.7 Day 20－1 －23.3 图2 MHV-3 感染后C3H/HeJ及C3H/HeN小鼠生存曲线图 3 讨论 TLR4广泛分布于免疫细胞及组织细胞表面，并能利用四种转接分子MyD88（myeloid differentiation primary response protein 88）、MAL（MyD88 adaptor like protein，MAL）、TIRAP（TIR associated protein，TIRAP）、TRIF （TIR domain containing adaptor protein inducing IFN-β）和TRAM（TRIF related adaptor molecule）传递信号级联反应，激活NF-КB、AP-1及IRF3等转录因子，诱导IFN-γ、IFN-β、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18、TNF-α等多种细胞因子的表达，具有多种生物学效应[13]。 近几年，TLR4在病毒性肝炎中的作用引起了人们的广泛兴趣。研究发现，HCV的非结构蛋白NS5A能特异性上调肝细胞和B细胞的TLR4的表达，增强细胞分泌IFN-β和IL-6的功能，诱导了抗病毒效应和炎症反应[2，14]。NS5A亦可与MyD88的死亡结构域结合，干扰髓样树突状细胞和巨噬细胞TLR4信号通路传导，抑制TLR4配体介导的细胞因子的产生，促进了HCV的持续感染[3-4，15]。而在HBV感染者中，Kupffer细胞TLR4下游TRIF信号通路激活，可以诱导干扰素的产生与分泌而抑制病毒复制[16-17]。但患者PBMC中TLR4的表达往往是下降的[6]，这可能是引起HBV持续复制的机制之一。 本实验室建立的MHV-3诱导的肝炎病毒持续感染C3H/He小鼠模型，在6~15d内出现急性肝炎的表现，并引起死亡，存活小鼠转为持续感染，对其急性肝炎向慢性化衍变期的免疫状态及病毒复制情况进行研究，是探讨病毒性肝炎慢性迁延的免疫机制的有力工具[8]。本研究中，TLR4缺陷的C3H/HeJ小鼠和TLR4正常的C3H/HeN小鼠在感染MHV-3后，临床症状变化时间基本一致：分别于感染后第4、5天出现临床症状综合评分显著下降，并分别于感染后第25、22天恢复至正常水平。两亚系小鼠出现集中死亡的时间点略有差异，C3H/HeJ小鼠在感染后第5天，而C3H/HeN小鼠在感染后第6天。死亡时间点的差异，导致了在感染后第5、6、13天，两亚系小鼠临床评分的差异。但两亚系小鼠死亡时间点非常接近，小鼠存活率及平均存活时间并未出现统计学差异。本研究结果提示，TLR4并不会影响MHV-3诱导的C3H/He小鼠病毒性肝炎的转归。这[第一论文 网(. ) 专业提供论文写作和写作论文的服务,欢迎光临]与早期的研究结论一致，不同小鼠品系对MHV病毒的敏感性主要与MHV受体相关[18]，同时也提示TLR4在MHV-3感染引起的宿主免疫应答中可能并不发挥主要作用。 虽然临床症状和一定的死亡率是MHV-3诱导的肝炎病毒持续感染C3H/He小鼠模型的重要特征，但这仅是MHV-3感染后引起的病理生理改变的一个方面。还需要进一步的研究，来比较两种亚系小鼠感染后细胞因子谱、肝脏病理、血清生化学指标以及肝内病毒复制水平等多个方面的改变，甚至与其他多种C3H/He亚系小鼠或基因敲除小鼠进行比较，才能明确TLR4是否在MHV-3感染引起的宿主免疫应答中发挥作用[7]。 本研究作为MHV-3诱导的肝炎病毒持续感染C3H/He小鼠模型的补充，其意义并不仅仅在于探讨TLR4在MHV-3感染中的作用。随着生活水平的提高和生活模式的转变，我国病毒性肝炎合并酒精性肝病（alcoholic liver disease， ALD）或非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease， NAFLD）的发病率逐步上升。已有研究证实，TLR4参与了ALD和NAFLD，以及HCV感染合并ALD引起的肝脏损伤[5， 14， 19-20]。采用TLR4正常的C3H/HeN小鼠替代TLR4缺陷的C3H/HeJ小鼠建立MHV-3诱导的肝炎病毒持续感染模型，可以为建立病毒性肝炎合并ALD/NAFLD动物模型奠定基础，对进行病毒性肝炎合并ALD/NAFLD的免疫学机制研究具有重要意义。 [参考文献] [1] Mogensen TH，Paludan g the viral signature by Toll-like receptors and other pattern recognition receptors[J].J Mol Med（Berl），2005，83（3）：180-192. 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