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外源性基因,胃癌相关甲基化基因的筛选与鉴定

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 p21waf1为野生型p53激活片段(wild-type p53 activated fragment 1,WAF1),它为单拷贝基因,是一种非常重要的抑癌基因,也是目前研究热点。因此,本研究将外源性p21waf1基因转染到人胃癌细胞系BGC-823中,使其稳定表达后,来研究其对人胃癌细胞增殖的影响。   1 材料与方法   1.1 实验材料 pIRES-p21waf1真核表达载体、人胃癌细胞系BGC-823(由青岛大学医学院附属医院中心实验室构建并惠赠),基因转染试剂盒(QIAGEN公司),Trizol试剂、DMEM-高糖培养基(Invitrogen公司),RT-PCR试剂盒(Takara公司),p21waf1及3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物及各自Taqman探针(由青岛大学医学院附属医院中心实验室提供),鼠抗人p21waf1单克隆抗体(Santa Cruz公司),兔抗鼠二抗、四甲基偶氮唑蓝(MTT)(QIAGEN公司)。   1.2 细胞培养方法 人胃癌细胞系BGC-823培养条件为含10%胎牛血清的DMEM-高糖完全培养液,37 ℃、5%CO2饱和湿度孵箱中孵育。倒置相差显微镜观察细胞形态,取对数生长期细胞进行相关实验。   1.3 基因转染条件和方法 参照QIAGEN转染试剂盒说明书进行。采用24孔板转染细胞,分三个组,分别为pIRES-p21waf1转染组、pIRES-neo空载体组、未转染组。   1.4 p21waf1 mRNA表达的检测 依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞,按照Trizol试剂盒说明提取总RNA。p21waf1基因引物设计:上游:5’-GGACAGCAGAGCACC   1.5 p21waf1蛋白表达的检测 依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞,提取细胞总蛋白,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,进行一抗(鼠抗人p21单克隆抗体)、二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗)孵育和显色,曝光并照相。使用HPIAS-1000型全自动图像分析仪分析蛋白条带灰度值。   1.6 细胞增殖能力的检测 各组均取对数生长期的细胞,采用经典的MTT法检测后,绘制细胞生长曲线,分析各组细胞的增殖能力。   1.7 细胞周期分布的检测 依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞,各约1×106个细胞,加入终浓度70%冷乙醇,4 ℃固定24 h,PBS洗涤离心三遍,加入Rnase酶(2 mg/ml)于37 ℃水浴30 min,再加碘化丙啶(25 mg/ml)染色,4 ℃避光20 min,经尼龙网滤过后,上流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况。   1.8 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件包进行处理,计量资料以(x±s)表示,两组间比较采用t 检验,计数资料采用 字2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。   2 结果   2.3 p21waf1基因转染对胃癌细胞BGC-823细胞增殖的影响 MTT证明,p21 waf1转染组胃癌细胞系BGC-823的增殖速度明显要低于空载体组、未转染组,p21waf1转染组在生长5 d后出现增殖速度减慢,而空载体组及未转染组则表现出持续增殖的态势,差异有统计学意义(P<0.01)。而空载体组及未转染组两组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各组p21waf1蛋白表达见图3。   3 讨论   据众多研究表明,细胞周期失去控制是肿瘤细胞恶性增殖重要原因之一。本研究将外源性p21waf1基因转染人胃癌细胞系BGC-823中后,p21waf1转染细胞组,p21waf1mRNA和p21waf1蛋白均高表达;p21waf1转染组BGC-823细胞生长速度低于空载体组和未转染组;流式细胞仪观察到p21waf1蛋白高表达使BGC-823细胞发生G1/S阻滞,G1期细胞数目明显要多于空载体组和未转染组,而S期细胞数则明显要低于空载体组和未转染组,并出现凋亡峰。笔者认为,外源性p21waf1基因转染且稳定表达后,可能通过p21waf1-cyclins-CDKs途径,起到对CDKs和PCNA的活性的双重抑制,进而使癌细胞DNA合成及细胞周期演进受阻,最终导致癌细胞增殖活性明显降低,大量停滞于G1期。根据本文结果,笔者认为,外源性p21waf1基因转染可以抑制人胃癌细胞系BGC-823细胞增殖和促进细胞凋亡,将来可能为研究胃癌的治疗方法提供一条新的思路。   参考文献   .中华肿瘤防治杂志,2011,18(14):1080-1083.   [2] Gartel,A L,Tyner,A role of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 in Apoptosis[J].Mol Cancer Ther,2002,(1)1:639-649.   .世界华人消化杂志,2009,17(14):1384-1389.   [4] 刘卫梅.p21在食管癌组织中的表达及临床意义[J].肿瘤基础与临床,2007,20(2):173-174.   [5] 王贵英,王士杰,李勇,等.细胞周期调控因子与癌发生的关系[J].国外医学:肿瘤学分册,2005,32(1):14-16.   .J Clin Onco1,2006,24(1):1770-1783.   .Nature,1995,374(1):386-388.   .Cancer Lett,2008,265(1):206-214.

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