作者：尚保华，韩淑英，郑丽坤，朱丽莎， 杨远明，米文生， 魏洪磊
【摘要】 目的研究荞麦花叶总黄酮（tfbfl）对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠的血糖、血脂和对胰岛素抵抗（ir）的影响,并探讨其作用机制。方法以脂肪乳灌胃联合低剂量四氧嘧啶注射方法制作2 型糖尿病大鼠胰岛素抵抗模型。将sd大鼠随机分为正常组，模型组，tfbfl高、中、低治疗组，罗格列酮（rsg）治疗组。连续灌胃6周后,测定空腹血糖(fbg),糖耐量（otgg），空腹胰岛素（fins），血清总胆固醇（tc），甘油三酯（tg），游离脂肪酸(ffa),糖化血红蛋白（ghb），计算胰岛素敏感指数(isi)和kitt。he染色观察胰腺和肾组织形态学改变。结果与正常对照组比较,模型组大鼠fbg，otgg，fins, tg, tc, ffa, ghb明显升高（p<0.05或p<0.01），isi明显降低（p<0.05或p<0.01）。与模型对照组相比, 荞麦花叶黄酮能使fbg, otgg, fins, tg, tc, ffa, ghb 降低（p<0.05或p<0.01）而升高isi（p<0.05或p<0.01）,呈一定剂量依赖性,高剂量组与罗格列酮相近。组织he染色光镜下观察显示，模型组大鼠胰腺及肾组织结构异常。wWW.lunwen.net.cn不同剂量的tfbfl均能明显改善上述组织的病理改变。结论tfbfl能够剂量依赖性的增加2型糖尿病大鼠胰岛素敏感性,改善胰岛素抵抗,对糖尿病大鼠各器官损伤具有保护作用。
【关键词】 荞麦花叶黄总酮 2型糖尿病 胰岛素抵抗
abstract:objectiveto study the effects of total flavones of buckwheat flowers and leaves on serum glucose , serum lipid and insulin resistance in type 2 diabetic rats with insulin resistance and try to find its sthe model of diabetic type 2 rats with insulin resistance was made by injecting alloxan and giving a gastric perfusion of intralipid. rats were randomly divided into normal group, model group, tfbfl 100, 200 and 400 mg ·kg-1 groups and rosiglitazone group. fasting blood glucose(fbg), ogtt ,fasting insulin (fins) ,insulin sensitivity inex(isi) ,kitt, free fatty acids (ffa) , triglyceride(tg), total cholesterol (tc), glycosylated hemoglobin (ghb) were measured after 6 weeks. the pancreas, fat, renal issues were stained by he so as to observe its morphologic changes. resultsfbg, fins, tg, tc, ffa, ghb significantly increased in the model group as compared with those in normal group, while isi was significantly reduced. fbg, fins, tg, tc, ffa, ghb significantly reduced in the tfbfl group as compared with those in model group, while isi was significantly increased in dose-dependent manner. the effects of high dose tfbfl treated group were similar to those of rsg group. he-stained organizations were observed that the model group organizational structure of the pancreas and kidney were abnormal. those pathologic changes in different dose tfbfl groups were significantly improved. conclusiontfbfl can increase insulin sensitivity, improve insulin resistance and protect organs of type 2 diabetic rats.
key words:total flavones of buckwheat flower and leaf; type 2 diabetes mellitus; insulin resistance
2型糖尿病（t2dm）胰岛素抵抗的发病率逐年增加，已成为严重威胁人类健康的慢性病，其危害性不仅在于它的发病率高，更主要的是它所导致的心脑血管疾病、失明、肾衰等各种并发症，因此糖尿病的防治刻不容缓。研究表明，荞麦种子提取物有许多药理活性，但对荞麦花叶的研究较少。我室前期研究发现荞麦花叶总黄酮（tfbfl）具有降糖、降脂、抑制体内外糖基化终产物的形成等作用［1,2］，本实验在此基础上，进一步观察tfbfl对实验性2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠的防治作用，探讨其防治糖尿病及其并发症的可能机制。
1 材料与仪器
1.1 药品与试剂荞麦花叶为甜荞麦子粒收割后自然干燥的花叶（来自内蒙古库伦旗），其水提取物经乙醇溶解过滤后，用旋转蒸发器回收乙醇，浓缩干燥即得荞麦花叶总黄酮（经中国医学科学院药物研究所鉴定提取物中总黄酮含量为92.2%）。罗格列酮（rsg,葛兰素史克有限公司，批号：20060916）;四氧嘧啶(alloxan) （美国sigma公司）；胰岛素（江苏万邦生化医药股份有限公司，批号：20070105）；胰岛素放射免疫分析试剂盒(原子高科股份有限公司)；胆固醇（北京双旋微生物培养基制品厂）；蔗糖（北京拜尔迪生物公司）；l－谷氨酸钠（北京拜尔迪生物公司）；1,2－丙二醇（天津北方天医化学试剂厂,分析纯），考马斯亮蓝试剂盒（美国sigma公司），血肌酐、游离脂肪酸、糖化血红蛋白等测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），甘油三酯、总胆固醇测定试剂盒（浙江东瓯生物工程有限公司），其他试剂为国产分析纯。
1.2 仪器血糖仪（韩国all medicus公司），tgl-16型冷冻低温离心机（上海安亭科学仪器厂），日立7150全自动生化分析仪（日本），722型分光光度仪（北京市六一仪器厂），数码照相机（日本佳能公司），电热恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂），motic med 6.0数码医学图像分析系统（北京航空航天大学），电热恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂），ft630g型微机多探头放免仪（北京市核仪器厂），mp200a型电子天平（上海），无菌操作台（上海），玻璃研磨器（天津）。
1.3 动物清洁级sd大鼠，雄性，体质量（200±20）g，北京中国医学科学院实验动物研究所提供，合格证号为scxk11-00-0006。
2 方法
2.1 大鼠糖尿病模型sd雄性大鼠70只,随机抽取10只作为正常对照组,每天灌胃蒸馏水,其余60只大鼠每天灌胃脂肪乳(猪油2 g,胆固醇0.5 g,谷氨酸钠0.1 g,蔗糖0.5 g,果糖0.5 g,吐温2 ml,丙二醇3 ml,丙硫氧嘧啶0.1 g,加水至10 ml),第14天腹腔注射四氧嘧啶100 mg/kg，隔日1次，共3次，同时继续灌胃脂肪乳。末次腹腔注射四氧嘧啶72 h后,用血糖仪测定空腹血糖,用毛细血管法判定胰岛素抵抗［3］，其方法为：待测大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射胰岛素0.05 u/kg，选取注射前，注射后15，30，60，120 min，5个时间点测血糖，用kitt值表示(以血糖为纵坐标,时间为横坐标,直线回归得回归系数r乘以100即kitt)，以空腹血糖≥16.7 mmol/l,同时kitt小于正常对照组的60％作为2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠,造模成功52只。
2.2 分组与给药将52只2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠随机分5组：模型对照组11只,灌胃水10 ml/kg；阳性药物组11只，灌胃rsg1 mg/kg，tfbfl低、中、高剂量组（l- tfbfl，m- tfbfl，h- tfbfl）各10只，分别灌tfbfl100，200，400 mg/kg。上述各组大鼠上午8点灌胃给药,2 h后灌胃脂肪乳,连续6周。
2.3 检测指标末次给药后禁食12 h，用血糖仪及配套血糖试纸测fbg，ogtt；比色法测定tg，tc，ffa，ghb；放免法测定fins，计算isi评价胰岛素抵抗的程度。按文献［4］方法：isi等于fbg与fins乘积倒数的自然对数，即isi=ln［1/（fins×fbg）］; he染色观察胰腺和肾组织形态学改变。
2.4 数据处理实验数据用spss10.0软件处理，以±s表示，用方差分析和t检验进行组间比较。
3 结果
3.1 tfbfl对糖尿病大鼠血糖、胰岛素和胰岛素敏感指数的影响与正常对照组相比，模型对照组血糖和胰岛素明显升高（p<0.01，p<0.05），而isi明显降低（p<0.01），说明已形成糖尿病胰岛素抵抗，类似2型糖尿病。tfbfl能明显降低血糖（p<0.05），高剂量组与阳性对照药罗格列酮相近。tfbfl高剂量组与阳性对照药罗格列酮能明显增加isi（p<0.05）。结果见表1。表1 tfbfl对糖尿病大鼠tbg，fins和isi敏感指数的影响（略）
3.2 tfbfl对2型糖尿病大鼠糖耐量及胰岛素抵抗的影响正常对照组灌服葡萄糖后2 h血糖水平基本恢复正常，模型组糖耐量各点血糖值均较正常对照组高（p<0.01），2 h血糖水平仍然很高，符合临床2型糖尿病胰岛素抵抗。而各剂量tfbfl治疗组和罗格列酮治疗组各点血糖值较模型对照组明显降低（p<0.05，p<0.01），tfbfl随着剂量的增加糖耐量改善更明显。结果见表2及图1。表2 tfbfl对糖尿病大鼠ogtt的影响（略）
3.3 tfbfl对糖尿病大鼠tg、tc、ffa和ghb的影响中、高剂量tfbfl能抑制2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠血清tg升高（p<0.01），高剂量tfbfl能抑制2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠血清tc、ffa 和 血液ghb的升高（p<0.01），高剂量组作用与罗格列酮相近。结果见表3。表3 tfbfl对糖尿病大鼠tg，tc，ffa和ghb的影响（略）
3.4 tfbfl对肾、胰腺病理改变的影响正常大鼠肾脏肾小球大小均匀，较为饱满，肾小管上皮细胞排列规则（图2a）；糖尿病模型肾脏肾小球大小不等，肾小球萎缩、变性坏死，肾小囊腔增大，肾小球基底膜增厚，肾小管萎缩，肾血管壁变厚，管腔狭窄，炎症细胞浸润（图2b）；给予tfbfl高剂量治疗组肾脏较糖尿病模型对照有明显改善(图2c)。正常大鼠胰岛数目较多、体积较大，呈现圆形或椭圆形细胞团状，边界清楚。胰岛内细胞数目、形态正常（图3a）；糖尿病模型组胰岛数目减少、体积萎缩，有明显出血灶,胰岛内细胞排列不规则，形态异常，边界不清，有大量炎细胞浸润，有明显出血灶（图3b）；tfbfl高剂量治疗组与模型组相比病变均较轻，胰岛体积有所增大，胰岛数量及胰岛内细胞数目增多，细胞的排列趋于规整，细胞形态、大小基本正常（图3c）。
4 讨论
胰岛素抵抗是糖尿病、肥胖和脂质代谢紊乱、动脉硬化、高血压病等多种慢性代谢相关性疾病的共同病理生理基础和2型糖尿病的显著特征［5］。目前认为改善ir及其相关的代谢异常已成为降低糖尿病发病率的重要防治策略。本实验结果显示，用灌胃脂肪乳和反复小剂量四氧嘧啶腹腔注射可使大鼠空腹血糖增高，kitt小于正常对照组的60％即胰岛素敏感指数降低，血清tc、tg、ffa和血液ghb显著增高，提示大鼠已经产生胰岛素抵抗和代谢紊乱。灌服荞麦黄酮干预治疗的大鼠可使其空腹血糖降低，tc、tg、ffa和血液ghb显著下降，改善糖耐量和胰岛素抵抗。
《中药大全》记载：“荞麦全草含芸香苷，槲皮素，咖啡酸等黄酮类化合物。有降糖、降脂、降低毛细血管通透性，抗炎等作用”。本课题组前期大量研究证明荞麦黄酮有降糖、降脂、抗炎、抗氧化等作用。荞麦花叶含多种黄酮类物质，主要有芸香苷（芦丁）、槲皮素等。研究表明ffa是糖尿病发生过程中重要的危险因素。本实验动物用脂肪乳和小剂量四氧嘧啶后可见血糖、血脂、ffa明显升高，kitt小于正常对照组的60％即胰岛素敏感指数降低，与胰岛素抵抗出现相一致。tfbfl降糖、降脂、改善胰岛素抵抗的作用，可能是通过降脂、降ffa、抗炎，减少了组织和血中游离脂肪酸残基和自由基的形成，从而减少了对组织损伤的攻击。同时病理组织学也证实tfbfl能明显改善肾和胰腺组织的病理损伤，表明tfbfl在降低糖尿病动物血糖的同时可纠正其脂类代谢异常，增加组织细胞对胰岛素的敏感性，改善ir的综合效应，抑制或延缓t2dm病程进展及并发症的产生。
综上所述，荞麦黄酮降糖、改善胰岛素抵抗的作用可能是通过多途径、多靶点作用产生的。对荞麦的研究处于起步阶段，它的许多功能还在进一步开发中，因此荞麦黄酮是一种很有开发前景的药物或保健食品。
【参考文献】
［1］韩淑英，陈晓玉，王志路，等.荞麦花总黄酮对体内外蛋白质非酶糖基化抑制的作用［j］.中国药理学通报，2004,20（11）：1242.
［2］辛念,齐亚娟,韩淑英,等. 荞麦花总黄酮对2型糖尿病大鼠高脂血症的作用［j］.中国临床康复,2004,27(2):5984.
［3］艾静,王宁,杜杰,等.wistar大鼠2型糖尿病动物模型的建立［j］.中国药理学通报,2004,20（11）:1309.
［4］李光伟,潘孝仁,stephen l,等.检测人群胰岛素敏感性的一项新指数［j］.中华内科杂志,1993,32(10):656.
［5］谭庆华.正常糖耐量与合并2型糖尿病的冠心病患者胰岛功能及胰岛素抵抗指数观察［j］.华夏医学,2005,18(1)：12.
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