作者：苑文英，刘秀华，耿彦生，于朝云，刘未华，唐志远
【摘要】 目的通过对大蒜素治疗和未治疗弓形虫感染小鼠免疫组织脾淋巴细胞数、肠系膜pp结数、肠内皮淋巴细胞数（iel）及对再攻击感染免疫力测定，了解大蒜素对免疫功能的影响。方法将小鼠分成治疗组、感染组和对照组，用5×104个/只rh株弓形虫速殖子经口感染小鼠，当天用大蒜素治疗，1次/d，持续14 d，治疗后0，2，4，6，8，10，12周断颈处死小鼠，记数脾淋巴细胞、肠系膜pp结、肠内皮淋巴细胞数（iel），并用1×106个/只速殖子再次感染小鼠，观察存活情况。结果在观察的时间段内，肠系膜pp结数无明显变化，脾淋巴细胞数、iel数治疗组高于感染组和对照组，以治疗后4，6，8周差异具有显著性（p＜0.05)。对再攻击感染免疫力测定结果显示，治疗组存活率高于感染组和对照组，差异具有显著性（p＜0.05)。结论大蒜素治疗经口感染弓形虫速殖子小鼠后，能刺激免疫组织增生，提高对再攻击感染存活率。
【关键词】 大蒜素； 弓形虫； 感染； 免疫组织； 存活率
刚地弓形虫(toxoplasma gondii)是一种细胞内寄生虫，可感染包括人在内的大部分宿主。急性感染阶段，速殖子在体内迅速增殖，机体对其免疫应答主要为ifn-γ介导的细胞免疫［1］。慢性感染是由于弓形虫由速殖子转为生长缓慢的包囊状态［2］，从而在宿主体内长期存在。在免疫抑制的个体中，如化疗病人、aids患者，弓形虫是一种重要的机会致病原，它可由慢性感染再燃而引起严重病变。为研究大蒜素在改善低剂量强毒株速殖子感染小鼠的免疫组织应答和存活情况，进行了此项实验，探讨通过调节免疫应答平衡来恢复免疫力的机制。
1 材料与方法
1.1 弓形虫rh株购自天津医科大学寄生虫学教研室，由河北大学医学部实验中心保种。
1.2 动物
spf级balb/c小鼠购自河北医科大学，由河北大学医学部实验中心动物室繁殖，8周龄。颗粒饲料喂养，自然光照、自由进食饮水。
1.3 药物
大蒜素，针剂，30 mg/支，上海禾丰制药有限公司产品，批号070802。
1.4 分组126只balb/c小鼠，随机分成感染组、治疗组和对照组，每组42只。rh株弓形虫速殖子5×104个/只经口感染小鼠，对照组灌服生理盐水，治疗组感染当天给大蒜素80 μg/只，1次/d，连续14 d，感染组灌服生理盐水替代。
1.5 指标及测定方法
1.5.1 脾t淋巴细胞分离与计数将脾置于300目不锈钢网上研磨，用pbs洗涤离心，淋巴细胞分离液分离试管内中层白色膜状淋巴细胞；用2%台盼蓝染色，计数淋巴细胞。
1.5.2 小肠pp结分离与计数摘取小肠，置于5%fbs-pbs中，计数小肠浆膜表面pp结数目(通常在肠系膜附着处对侧，丘状隆起，色泽较白)。
1.5.3 小肠上皮内淋巴细胞（iel）分离与计数将去除pp结和冲洗肠液后的小肠剪成1～2 cm的小段，并纵行剪开，将洗过的肠段悬浮在含edta的pbs烧杯中，37℃磁力搅拌1 500 r/min×30 min。300目不锈钢网过滤，再用内装脱脂棉过滤，过滤后2 500 r/min×8 min离心，沉淀物用percoll密度梯度离心法将iel与肠上皮细胞分离。用微量移液器吸出白色雾状iel层，2%台盼蓝染色后计数iel。
1.5.4 对再攻击感染免疫力测定取对照组、感染组和治疗组各42只共126只小鼠，于实验第8周用1×106个/只速殖子再次感染小鼠，观察至43周结束，记录活动情况、计算存活率。
2 结果
2.1 脾t淋巴细胞数变化在观察的实验周期中，对照组小鼠脾淋巴细胞总数无明显变化，感染组、治疗组在感染后第2周开始增生，第4周达高峰，第6周降至对照组水平，第4周明显高于对照组(p<0.01)。结果见表1。 表1 小鼠脾淋巴细胞数（略）
2.2 小肠pp结数变化在观察的实验周期中，各组小鼠小肠pp结数目均无明显变化，治疗组平均为8.60个，感染组为8.34个，对照组8.46个，3组比较无显著差异（p＞0.05)。结果见表2。
2.3 小肠上皮内淋巴细胞（iel）数变化实验周期内对照组小鼠iel数量有轻微变化，但无显著性。感染组和治疗组显著增生，第4周有显著性差异，随后逐渐下降，第8周降至对照组水平。第4，6周组间比较有显著性差异(p<0.01)。结果见表3。表2 小肠pp结数目（略）表3 小鼠小肠上皮内淋巴细胞（iel）数（略）
2.4 再攻击感染存活率治疗组小鼠存活率显著高于感染组和对照组(p<0.01)。见表4。表4 各组小鼠存活率（略）
3 讨论
弓形虫是细胞内寄生虫，感染机体后主要引起细胞免疫，t细胞在此免疫中具有很重要的作用［3］，脾脏是人体最大的淋巴器官，脾t细胞对外来抗原或疫苗刺激的增殖性反应代表机体系统免疫应答水平。freyre a ［4］等用弓形虫卵囊经口感染孕猫进行免疫研究发现，感染后猫出现严重的临床表现，甚至是致死性的威胁，肠系膜淋巴结发生病理变化是在第6天左右。barragan a ［5］等用弓形虫包囊口服感染小鼠，发现能透过生理屏障感染其他部位，诱导肠道应答高峰在感染后第6天并持续至第7，8天。陈光认为“大蒜素能抵抗弓形虫速殖子进入细胞，特别使抑制在细胞内增殖作用明显，机理是诱导虫体凋亡和直接杀死，通过调节免疫应答平衡来恢复免疫力的”。
为与包囊感染发生的免疫应答进行对比，观察不同毒力虫株和感染方式的进程及后果，我们实验采用强毒株rh株速殖子经口感染小鼠，结果显示：治疗组、感染组、对照组脾t细胞和小肠上皮内淋巴细胞（iel）数在第4，6，8周有显著性差异，各组小鼠小肠pp结数目无明显变化，说明经口感染速殖子也能有效刺激脾t细胞增生，并且大蒜素加强了这种增生能力，小肠pp结不是靠数量的增多发挥免疫作用的，主要是组织结构的变化促使功能加强，肠道黏膜免疫效应部位iel是体内最大淋巴细胞群［6］，因其特殊的定位而成为黏膜表面抵抗病原体入侵肠道的首道免疫屏障，增生明显、持续时间长，是效应部位发挥免疫的主要组织［7］，当抗原再次暴露于接触过低剂量强毒株速殖子感染小鼠的免疫组织时，应答迅速，使存活率明显提高，特别是大蒜素增强了免疫能力［8］。
【参考文献】
［1］nguyen td, bigaignon g, markine-goriaynoff d, et al. virulent toxoplasma gondii strain rh promotes t cell一independent overproduction of proinflammatory cytokines il 12 and gamfna-interferon［j］. t med microbiol， 2003，10(52):869.
［2］刘涛，徐秀菽，叶红兵，等.弓形虫隐性感染动物模型的建立［j］. 贵州医药，2001,25(12):1122.
［3］殷国荣，韩剑峰，刘红丽，等.经口感染弓形虫诱导的小鼠肠道黏膜t细胞亚群变化［j］.中国寄生虫病防治杂志，2004，17(4):199.
［4］freyre a,falcon j,correa o,et al. fetal toxoplasma infection after oocyst inoculation of pregnant rats［j］. parasitol res, 2003, 89(5): 352.
［5］barragan a, sibley l ion of toxoplasma gondii across biological barriers［j］. trends microbiol,2003,11(9): 426.
［6］刘红丽，殷国荣，沈嬿琼，等.小鼠过继转移致敏小肠iel抗弓形虫感染［j］.热带医学杂志，2005，5(1): 15.
［7］holmgren j, czerkinsky c. mucosal immunity and vaccines ［j］. nat med, 2005, 11(4 suppl): 45.
［8］ichinohe t, watanabe i, ito s, et al. synthetic double-stranded rna poly (i: c) combined with mucosal vaccine protects against influenza virus infection［j］. j virol, 2005, 79(5): 2910.
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