大鼠骨髓间充质干细胞形态(小鼠骨髓间充质干细胞)

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【关键词】 间充质干细胞；淋巴细胞；细胞增殖

【摘要】 目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的影响。方法:常规分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞(mscs)及淋巴细胞,灭活后的骨髓间充质干细胞和淋巴细胞混合培养48h后，mtt法检测淋巴细胞的相对细胞数，hoechst 33258染色观察细胞核变化。结果:mtt结果显示，加入mscs组od值明显低于未加mscs的对照组（p＜0.05）。hoechst 33258染色显示mscs组淋巴细胞有核固缩及凋亡小体出现。结论:mscs对淋巴细胞的增殖有抑制作用，其作用机制可能与细胞凋亡有关。

【关键词】 间充质干细胞；淋巴细胞；细胞增殖

骨髓间充质干细胞（mscs）是骨髓中的具有多向分化潜能的干细胞，在造血调控、组织工程和基因治疗等方面具有广阔的临床应用前景。已有实验表明体外扩增培养的msc可以抑制混合淋巴细胞反应,减轻移植排斥,延长移植物的生存时间等,其免疫调节功能研究已是移植治疗中的研究热点[1-3]。我们实验显示mscs对淋巴细胞的增殖抑制作用明显，其作用机制可能与细胞凋亡有关。现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及仪器

sd大鼠购自四川大学华西医学中心动物中心,6周龄，体重约60～80 g。m、rpmi1640培养基（美国gibco公司），淋巴细胞分离液(pharmacia公司),il2(sigma公司),青霉素、链霉素（华北制药有限公司），小牛血清（兰州中美合资民海生物有限公司），胰蛋白酶（美国gibco公司），超净工作台(日本nuair公司),二氧化碳培养箱（日本sanyo公司），倒置相差显微镜（日本olympus公司），全自动酶标仪（德国biorad，model 550)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠mscs的分离和培养采用全骨髓培养法分离培养mscs。48 h后弃悬浮细胞，继续培养已贴壁细胞。细胞生长至80～90％融合后，改用10%小牛血清的dmem低糖培养基传代培养。

1.2.2 大鼠脾脏淋巴细胞的制备无菌取出大鼠脾脏，研磨过尼龙网，分散的淋巴细胞透过尼龙网后应用淋巴细胞分离液获得淋巴细胞。洗涤2次后重悬于10%小牛血清的rpim1640培养基中。在37℃饱和湿度的co2孵箱中孵育2-4 h后，收集未贴壁悬浮细胞。

1.2.3mtt法淋巴细胞混合反应实验 取第三代对数生长期mscs经30gy60co照射后按1×104个/孔，淋巴细胞按5×104个/孔的种入96孔板中，各孔均加入刺激剂il2（1000 u·ml-1）。37℃饱和湿度co2孵箱中孵育48 h，mtt法检测淋巴细胞相对细胞数。

1.2.4 hoechst 33258染色经30gy60co照射后的mscs与淋巴细胞按1:5比例接种于含10%胎牛血清的rpim1640培养基的25 cm2培养瓶中，并加入刺激剂为il2（1000 u·ml-1）。co2孵箱中培养48 h后采用50 μg·ml-1 hoechst 33258染色10 min，pbs洗涤2次后涂片，荧光显微镜下观察细胞核。

2 结果

2.1 msc的分离、培养及鉴定 msc通常在培养2天左右,可以出现单个分散存在或形成只有几个细胞的克隆,细胞形态呈长梭形。贴壁的msc增殖迅速,培养10天左右每个克隆包含100-200个细胞,12-15天时细胞呈现80-90%融合(图1)。体外分化实验显示其能分化为成骨、成软骨及神经等多种细胞。

图1 原代培养第3代大鼠骨髓间充质干细胞

2.2 mscs抑制淋巴细胞增殖作用结果 mtt结果显示加入mscs的实验组淋巴细胞数比未加mscs的对照组明显减少，并具有统计学意义（p＜0.01），见表1。表1 mscs抑制淋巴细胞增殖作用结果*注：*与对照组相比，p＜0.012.3hoechst 33258染色结果经il2刺激培养48 h后，与mscs共同培养的淋巴细胞有分裂的细胞核碎片出现，而未加mscs的淋巴细胞细胞核完整，没有核固缩和核脆裂现象。mscs的实验组淋巴细胞凋亡率明显升高（p＜0.01），见表1。

3 讨论

对msc功能研究发现,其除可以作为组织工程研究的种子细胞外,还具有支持体外造血,促进体内造血重建的功能。最近研究发现msc具有免疫负调节作用，如诱导免疫耐受，抑制排斥反应，提高器官移植的成功率并能减轻自身免疫疾病的病情等[2-5]。

本实验证实mscs可在体外显著抑制由il2引起的淋巴细胞增殖，同bartholomew等[3,4]报道一致。已有研究表明mscs不仅引起了淋巴细胞的增殖停滞，还可能诱导了淋巴细胞的凋亡或死亡。如plumas[6]等发现mscs可以引起活化淋巴细胞凋亡的发生，其原因可能与吲哚胺2，3－二氧化酶的作用有关。我们也发现与mscs共同培养48 h后的淋巴细胞出现核固缩及分裂的细胞核小块，推测mscs可能诱导了淋巴细胞的凋亡，但其作用机制尚待进一步研究。

总之，mscs对淋巴细胞的增殖抑制作用确切，有望在移植治疗中得到拓展及应用。

【参考文献】
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3 bartholomew a, sturgeon c, siatskas m,et al. mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo [j]. exp hematol, 2002, 30(1): 42-48.

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5 krampera m, glennie s, dyson j, et al. bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigenspecific t cells to their cognate peptide [j]. blood, 2003, 101(15): 3722-3729.

6 plumas j, chaperot l, richard mj, et al. mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated t cells[j]. leukemia, 2005, 19 (9):1597-1604.

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