目的 研究慢性乙肝（CHB）患者阿德福韦酯治疗前后及HBV携带者CD8+T细胞表面活化分子CD38和HLA-DR表达情况，并探讨其与疾病进展的关系。 方法 收集32例经阿德福韦酯治疗的CHB患者，31例HBV携带者和28例正常对照，采集CHB患者治疗前后及HBV携带者和正常对照外周血。采用流式细胞术检测CD4+和CD8+T细胞数量和比例，以及CD8+CD38+和CD8+HLA-DR+T细胞比例，HBV DNA和生化由本院检验室检测。 结果 CHB患者治疗前CD8+CD38+T细胞比例显著高于HBV携带者和正常对照组，阿德福韦酯治疗后显著降低（P<0.05）。HBV携带者CD8+CD38+T细胞比例高于正常对照组（P<0.05）。CHB患者治疗前CD8+HLA-DR+T细胞比例显著高于正常对照组（P<0.01），但与HBV携带者无明显差异，阿德福韦酯治疗后显著下降，仍高于正常水平（P<0.05）。 结论 HBV感染可以引起CD8+T活化水平显著升高，阿德福韦酯抗病毒治疗能够降低CD8+T的活化。CD8+T活化水平是良好的HBV感染病情评价指标。
HBV；慢性乙肝；免疫活化；CD38；HLA-DR
R512.62 B 1673-9701（2014）34-0014-04
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一种非细胞致病性病毒，HBV感染的临床结果主要依赖于宿主的免疫应答情况。研究发现T细胞免疫应答对HBV感染的进展十分重要，其中CD8+T细胞免疫应答对控制病毒的复制起主要作用。缺乏高强度的、特异性的免疫应答是导致慢性乙肝（chronic hepatitis B，CHB）病毒清除失败和疾病进展的主要原因。研究外周血T细胞免疫活化状态对揭示CHB发病机制具有重要意义，尤其是CD8+T细胞的免疫活化。CD38分子是一种表达在早期T细胞表面的糖蛋白，成熟以后消失，但是T细胞活化后又重新出现。作为T细胞免疫活化的标志，CD38在许多急性或慢性感染中均会表达升高，如人类免疫缺陷病毒（HIV）、EB病毒（EBV）等感染。另外一个T细胞免疫活化的指标是人类白细胞抗原-DR（HLA-DR），在HIV的感染中可作为预测疾病进展的指标之一。到目前为止，对HBV感染者及CHB患者T细胞免疫活化的研究较少。本文对慢性乙肝患者阿德福韦酯治疗前后及HBV携带者CD8+T细胞表面活化分子CD38和HLA-DR表达情况进行研究，并探讨其与病毒复制和疾病进展的关系。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选取我院2010年6月～2011年6月接受阿德福韦酯抗病毒治疗的CHB者32例，其中男20例，女12例，平均年龄（50.2±22.4），平均病程（6.5±5.7）年。诊断标准符合2000年西安全国第10届病毒性肝炎会议所修订的《病毒性肝炎防治方案》诊断标准，并排除其他病毒性肝炎、酒精、药物引起的肝损伤等。入组后接受阿德福韦酯10 mg/d 治疗12个月以上。另外，选取HBs抗原阳性的乙肝携带者31例，其中男22例，女9例，平均年龄（44.8±26.9）岁。以本院门诊体检者32人（均无特殊病史，体检无异常发现，anti-HBsAg（-），近2个月无感染史）作为正常对照组，男18例，女10例，平均年龄（42.1±20.6）岁。
1.2 样本的采集
采集慢性乙肝患者治疗前及治疗12个月后的外周血2 mL/人，以及HBV携带者和正常对照组血样2 mL/人，无菌EDTA抗凝管收集做流式细胞术检测，另外采集血样分别送化验室进行生化及HBVDNA等检测。
1.3 流式细胞术检测
荧光标记的单克隆抗体购自美国BD公司，CD4+和CD8+T细胞计数采用BD公司的细胞计数管，其余细胞比例检测采用普通流式管。每管加入50 μl血样及相应抗体，抗体组合如下：CD3-PE/CD4-FITC，CD3-PE/CD8-FITC，CD3-PE/CD8-FITC/CD38-APC，CD3-PE/CD8-FITC/HLA-DR-APC。标记好的血样室温避光孵育15 min，裂解红细胞后，采用BD公司FACScan四色流式细胞仪进行检测。
1.4 统计学分析
检测结果均以均数±标准差表示，应用SPSS 15.0软件进行数据分析，定量资料两组间数据比较采用t检验，多组间数据比较采用One-Way ANOVA（SNK法），相关性分析Person’s检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CHB患者、HBV携带者及对照组生化和免疫学比较
CHB患者平均治疗时间为（18.8±5.7）个月，治疗前后相比ALT、TBIL和HBV DNA均有显著下降（P<0.05），CD4+T细胞数量有所上升，CD8+T细胞数量下降（P均>0.05），但仍显著低于正常水平（P<0.01），CD4+T细胞比例改变不明显，CD8+T细胞比例治疗前显著高于正常对照组，治疗后与治疗前比显著下降（P<0.05）。HBV携带者HBV DNA显著高于CHB治疗前，CD4+T细胞数量和比例均高于CHB患者治疗前水平，但CD4+T细胞数量低于正常水平（P均<0.05），CD8+T细胞水平与其余组比较无显著差异。见表1。
2.2 各组CD8+T细胞免疫活化情况比较
CHB患者治疗前CD8+CD38+T细胞比例显著高于HBV携带者和正常对照组，阿德福韦酯治疗后显著降低，低于HBV携带者水平，但仍稍高于正常水平，HBV携带者CD8+CD38+T细胞比例高于正常对照组。以上P均<0.05，见图1A。
各组CD8+HLA-DR+T细胞比例均低于CD8+CD38+T细胞比例，CHB患者治疗前CD8+HLA-DR+T细胞比例显著高于正常对照组（P<0.01），但与HBV携带者无明显差异，阿德福韦酯治疗后显著下降，仍高于正常水平（P<0.05）。见图1B。
2.3 CD8+T细胞免疫活化与病毒学和免疫学指标的相关性分析
CD8+CD38+%和CD8+HLA-DR+%与HBV感染的病情指标均表现出良好地相关性。具体为CD8+CD38+%和CD8+HLA-DR+%与HBV DNA 和ALT水平呈正相关（P<0.05），与CD8+T细胞数呈负相关（P<0.05），与CD4+T细胞数也呈负相关，但P>0.05。见表2。
3 讨论
除了HBV DNA和肝功能外，T细胞的活化状态也是评价HBV感染的重要指标，但是目前这方面的研究报道不多。既往的研究发现，CHB患者与正常人群及HBV携带者相比，外周血T细胞亚群存在比例失衡，体现在CD8+T细胞比例增高、CD4+T细胞比例及CD4+/CD8+的下降，这与我们的研究相符。在我们的研究中HBV感染能够引起CD8+T细胞的显著活化，并且CHB患者的活化程度高于HBV携带者，说明CD8+T细胞的活化参与了CHB的发病过程。许多研究发现，CD8+T细胞在病毒的清除和疾病的进展方面起有重要作用，CD8+T细胞的活化反映了CD8+T细胞清除病毒的能力。但另一方面 ，CD8+T细胞的过度活化又会引起机体的免疫损伤，造成疾病进展。我们的研究发现，CD8+CD38+和CD8+HLA-DR+T细胞的比例与CD4+和CDC8+T细胞的数量呈反比，说明CD8+T细胞免疫活化可能是造成CHB患者和HBV携带者CD4+T细胞和CD8+T细胞数量下降的重要原因。Cao等研究发现，在CHB患者中存在持续的慢性免疫活化，但不如在HIV和EBV感染中的强烈，这可能与HBV感染主要局限于肝脏有关。大量激活的T细胞，包括CD4+T细胞核CD8+T细胞，最终大部分会凋亡，只有少数会转化为静息型的记忆细胞存活下来。长期慢性的过度免疫活化导致HBV感染者CD4+和CD8+T细胞大量消耗，最后导致免疫功能下降，不能抑制病毒的复制，进展到慢性肝病期。
CD38和HLA-DR分子做为T细胞免疫活化的标志，与许多病原体感染有关。有研究发现，在HIV感染中，CD8+CD38+和CD8+HLA-DR+反映的免疫活化水平与HIV疾病的进展密切相关，CD4+T细胞的缺失与免疫活化水平有直接关系，CD8+CD38+和CD8+ HLA-DR+百分比比病毒载量更能反映机体的免疫活化情况。我们的研究发现，在HBV感染中，CD8+CD38+和CD8+ HLA-DR+百分比与HBV DNA和ALT呈正相关，这与Cao等的研究结果一致。我们的研究结果提示，CD8+T细胞的活化程度与HBV造成炎症反应程度密切相关，是引起肝脏炎症损伤的重要原因之一。因此，免疫活化指标，尤其是CD8+T细胞上CD38和HLA-DR分子的表达是评价HBV感染者病情的良好指标。
此外，我们的研究还发现，阿德福韦酯抗病毒治疗不仅可以抑制CHB患者体内HBV的复制，使病毒载量显著下降，而且使免疫活化水平显著下降，接近正常水平，但仍然偏高。这一结果表明，CD8+T细胞的免疫活化的直接原因可能是HBV的大量复制，CD8+T细胞免疫活化程度与HBV DNA拷贝数的正相关也证明了这一点。另外，在HIV-1感染中的研究发现，接受高效抗逆转录病毒治疗的艾滋病患者，即使HIV复制被完全抑制，病毒载量下降到检测不到的水平，CD8+CD38+和CD8+ HLA-DR+T细胞的比例仍然高于正常水平，这可能是因为虽然病毒复制水平被抑制到检测限以下，但仍然有少量的病毒持续存在，使T细胞的免疫活化维持在较高水平。对接受阿德福韦酯治疗的CHB患者的随访研究发现，CD8+T细胞的免疫活化在治疗开始的12周内就开始下降，并随着治疗时间的延长发生迅速、持续地降低，并有许多患者恢复到正常水平。这些研究进一步证明，病毒颗粒本身是导致CD8+T细胞免疫活化的直接原因。因此，及时的、持续的抗病毒治疗，最大限度地降低病毒载量，是减少HBV感染者CD8+T细胞免疫活化的重要治疗措施。
综上，我们的研究表明，HBV感染可以导致机体CD8+T细胞的免疫活化，并且这种免疫活化与HBV感染病情进展有关，并可能参与了CHB的发病过程。阿德福韦酯不仅可以抑制HBV的复制，降低病毒载量，还可以通过降低CD8+T细胞的免疫活化，进而改善CHB患者的免疫状况，减少炎症损伤和T细胞的消耗。进一步的研究需要对接受抗病毒治疗CHB患者进行更长时间的随访。
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