【摘要】 目的: 研究趋化因子ccl20对小鼠胸腺cd4+cd25+双阳性t细胞发育的影响, 为天然调节性t细胞调控的研究提供基础数据。方法: 采用14.5 d龄胚鼠胸腺进行体外培养, 以流式细胞术（fcm）检测不同时间点胸腺cd4+cd25+细胞的变化, 同时计数每个胸腺小叶的细胞数变化。结果: 体外胸腺培养的第1～6天胸腺细胞比例, 细胞数量趋势变化与胸腺体内发育的第14.5、 15、 16、 17、 18、 19天cd4+cd25+双阳性t细胞的比例, 细胞数量的趋势变化相似; 在胸腺体外培养的第1～6天, cd4+cd25+t细胞占cd4+t细胞的比例分别为58.29%、 12.14%、 6.08%、 17.78%、 9.06%、 4.04%, 占cd25+t细胞的比例分别为3.75%、 10.81%、 17.20%、 51.93%、 61.64%、 80.06%, 这一发育趋势与体内结果具有一致性。在4 mg/l的ccl20干预下, 胸腺体外培养的第3、 6天cd4+cd25+胸腺细胞分别从3.24±0.18、 3.96±0.24下降至1.27±0.11、 1.76±0.22（p<0.001）。结论: 体外培养的cd4+cd25+双阳性胸腺细胞数量和比例变化与体内发育变化趋势一致, ccl20明显下调胸腺cd4+cd25+的表达, 这将为天然调节性t细胞的调控研究提供有效的参考依据。
【关键词】 胸腺细胞 cd4+ cd25+ ccl20 体外胸腺器官培养
sakaguchi等[1]研究发现, 给小鼠输入cd4+cd25+t细胞, 会下调免疫应答, 研究者们进一步在动物模型和临床病例证实该细胞参与自身免疫病的发生、 肿瘤的免疫逃避以及移植物抗宿主反应。随后的研究证实了该群细胞为cd4+cd25+foxp3+调节性t细胞, 小鼠体内输注经同种抗原活化的cd4+cd25+t细胞, 可引起特异性免疫耐受[2], 不仅如此, 它在免疫系统发育、 自身免疫、 肿瘤逃逸等过程中均扮演重要的角色, 成为当前免疫学研究的热点。调节性t细胞分为天然调节性t细胞和诱导调节性t细胞, 其中天然调节性t细胞对机体具有举足轻重作用。目前就其来源、 亚群、 特点、 转归及其在t细胞活化中的作用研究都有了长足的进展, 但对这群细胞在胸腺发育中的变化及调控因素尚不清楚。而ccl20是cc亚家族的趋化因子[3], 该趋化因子的受体分布于未成熟的树突状细胞、 t细胞、 b细胞上[4-6], 在固有免疫和获得性免疫中都发挥着重要的作用[7]。人们对ccl20的研究显示该趋化因子在胸腺中表达明显[8], 其受体ccr6是调节性t细胞的标志之一[9], 但其在胸腺中存在的意义以及其是否参与胸腺cd4+cd25+t细胞的发育尚不清楚, 因此本研究拟采用不同孕龄的胎鼠, 以体外胸腺器官培养（fetus thymus organ culture, ftoc）技术在体外以ccl20对调节性t细胞进行干预实验, 对cd4+cd25+t细胞的体内外发育状态进行比较研究, 以期为该群细胞发育和调控的深入研究提供了依据。
1 材料和方法
1.1 材料 8周龄左右成熟雌性和雄性balb/c小鼠(h2d), 雌鼠120只, 雄鼠20只, 由复旦大学实验动物中心提供。不同日期的孕鼠由本实验室负责交配完成。细胞培养试剂rpmi1640（gibco brl公司）、 l谷氨酰胺（政翔化学试剂研究所）; 双抗（氨苄青霉素钠、 硫酸链霉素）（上海第四制药厂）; 小牛血清/nbs（上海华美生物公司）; 胎牛血清（浙江四季清生物制品有限公司）; fitc标记兔抗小鼠cd4单克隆抗体（mab）（becton dickinoson公司）; pe标记山羊抗小鼠cd25 mab（becton dickinoson公司）。显微外科镊、 剪（上海医疗器械有限公司）; 0.8 μm微孔滤膜（上海半岛实业有限公司）; d6450hanao co2培养箱（heraeus公司）; facscalibur流式细胞仪（becton dickinoson公司）。趋化因子ccl20（1 g/l, 达科为公司）。
1.2 方法
1.2.1 孕鼠交配与鉴定 按照我们已建立的孕龄测定方法和体外培养系统, 取成熟雌性小鼠2～3只和雄性小鼠1只于前1 d晚9∶00左右合笼, 次日晨8∶00左右取出雌性小鼠, 以见到阴栓形成为确认怀孕日期, 并计算为0 d, 将其单独饲养并标记, 在14.5 d时再次观察腹部确认怀孕, 解剖孕鼠, 摘取胚鼠胸腺小叶用于实验[10]。
1.2.2 胚鼠胸腺器官的培养 医用明胶海绵切成1 cm2左右的方块, 放入24孔板中, 加入1 ml rpmi1640培养液（含200 ml/l fbs）。灭菌滤膜充分湿润后覆盖在明胶海绵上, 吸弃0.5 ml培养液, 使24孔板中最终剩0.5 ml培养液。颈椎脱位处死孕鼠, 从孕鼠子宫中取出胚鼠, 置于加有pbs的100 mm的平皿中, 根据大小等特征再次判断其胚龄。剪开胚鼠胸腔, 取出胸腺小叶经pbs充分清洗, 每孔加8个胸腺小叶, 每组均为双复孔进行培养。ccl20干预组在培养的第0、 3天加趋化因子ccl20（终浓度为4 mg/l）。体内胸腺细胞发育过程的研究分别取不同孕龄的母鼠, 依照以上步骤取出胸腺小叶后, 制成单细胞悬液, 计数、 染色[10]。
1.2.3 流式细胞术检测 制备胚鼠胸腺单细胞悬液。毛玻片碾碎, pbs洗3次, 弃上清, 调整细胞数为2.5×109/l, 加入1 μl fitc标记cd4和pe标记cd25 mab（10 mg/l）, 轻轻混匀, 4℃, 避光, 静置30 min。pbs洗3次后, 用500 μl pbs重悬, 流式细胞术检测。检测体外培养胸腺时, 将胸腺小叶从滤膜上取出, 依照以上方法制成悬液并染色, bdcaliber机型检测, cellquest软件分析[10]。
1.2.4 统计学处理 所得数据用spss11.5软件处理。
2.1 体外及体内胸腺细胞总数的变化 系统反映存在于胸腺细胞中的cd4+cd25+双阳性细胞的体内外发育状况, 首先观察了整个胸腺细胞的数量变化。结果显示: 14.5 d胚龄鼠的胸腺细胞为双阴性时期或者稍有阳性, 是进行胸腺细胞发育研究的最佳起始时间[10]。体内发育过程中, 胎鼠胸腺小叶随发育时间增加逐渐增大, 胸腺细胞总数随母鼠育龄的增加持续增多, 从第14.5天的0.59×104/每叶胸腺增加至第15天时的0.74×104/每叶胸腺, 出生前每叶胸腺的细胞数量上升至2.68×106, 出生24 h内检测发现每叶胸腺的细胞数进一步增至6.43×106。与体内胸腺细胞发育规律类似, 体外培养显示: 在6 d时间内, 胸腺细胞表型由cd4-cd8-双阴性向cd4+cd8+双阳性细胞发育。体外培养时肉眼可见胸腺小叶比培养起始时有形态的增大, 细胞计数显示每个胸腺小叶细胞数量随培养时间的增加而增多。培养第1天时每个胸腺小叶的细胞数量比刚取出时略有下降, 从第0天的0.59×104下降为0.51×104, 第2天开始上升, 到第6天时每个胸腺小叶细胞数量增长到1.38×106（图1）。
图1 胚鼠胸腺细胞数目的体内外动态变化（略）
2.2 cd4+cd25+双阳性胸腺细胞的体内外发育 进一步研究cd4+cd25+双阳性胸腺细胞的体内外发育状况显示: 在体内情况下, 14.5 d胚鼠的胸腺细胞中cd4+cd25+占全部胸腺细胞的比例为0.13%, 17 d增至峰值4.13%, 而后降低至19 d的2.03%（图2a）。cd4+cd25+细胞数在14.5 d为0.025×104/胸腺小叶, 17 d增加至3.07×105/胸腺小叶, 而后增至19 d的5.41×104/胸腺小叶（图2b）。cd4+cd25+占cd4+细胞的比例在14.5 d为9.19%, 16 d增至峰值24.05%, 而后持续降低至19 d的2.35%（图2c）。cd4+cd25+占cd25+细胞的在14.5 d比例为0.35%, 后随发育时间的增加而持续增至34.04%（图2d）。体外培养的胸腺细胞与体内胸腺细胞发育规律类似: 体外培养1 d时, 胸腺细胞中cd4+cd25+的比例体内为1.87%, 4 d增至峰值10.85%, 而后降低至6 d的3.54%（图2a）。cd4+cd25+细胞数在1 d为0.01×104, 4 d增加至4.31×104, 持续增至6 d的4.89×104（图2b）。cd4+cd25+占cd25+细胞的在1 d比例为3.75%, 持续增加至80.06%（图2d）。仅cd4+cd25+占cd4+细胞的比例与体内不同, 在1 d为58.29%, 而后持续降低至6 d的4.04%（图2c）。
图2 胚鼠胸腺细胞中cd4+cd25+细胞的体内外动态变化（略）
a: cd4+cd25+胸腺细胞百分比; b: cd4+cd25+胸腺细胞数; c: cd4+cd25+/cd4+百分比; d: cd4+cd25+/cd25+百分比.
2.3 ccl20干预胸腺cd4+cd25+细胞的发育 由于ccl20表达于胸腺中, 为了研究ccl20是否对胸腺cd4+cd25+细胞的发育产生影响, 以一定浓度的ccl20与胸腺细胞共培养, 结果显示在不同培养时间点均有不同程度的影响（表1）, 在培养的第3、 6天, cd4+cd25+胸腺细胞的比例明显降低, 进一步的实验表明ccl20浓度的增加, cd4+cd25+胸腺细胞在体外培养时其所占胸腺细胞的比例呈剂量依赖关系（图3）, 提示ccl20在胸腺cd4+cd25+细胞的发育过程中扮演着重要作用。
图3 ccl20抑制胸腺细胞的发育呈剂量依赖性（略）
表1 ccl20（4 mg/l）干预胸腺cd4+cd25+细胞的发育（略
3 讨论
国内有文献显示胎儿胸腺细胞悬液可抑制混合淋巴细胞反应, 提示胸腺中存在具有抑制功能的一群细胞。由于其具有的独特作用方式和功能特征, 天然产生的cd4+cd25+treg细胞受到广泛关注, 该细胞表面表达非专一的cd25/cd62l/cd103/ctla4/git/foxp3等分子标记[11]。
外源性分子对胸腺细胞的数量和表型可能产生一定程度的影响[12], 胸腺髓质树突状细胞对cd4+cd25+treg细胞的发育分化有作用, 共刺激分子和细胞因子也参与了胸腺cd4+cd25+treg的产生[13], 为了研究趋化因子ccl20是否对胸腺细胞中的cd4+cd25+双阳性细胞的发育有调控作用, 首先观察了总的胸腺细胞的数量情况和cd4+cd25+双阳性胸腺细胞体内外发育状况, 该群细胞在体内外的数量和比例变化表现具有一致性。
在上述试验的基础上, 进一步比较了cd4+cd25+双阳性t细胞的体内外发育状况。随着胚鼠在母鼠体内的发育, 胸腺细胞中cd4+cd25+的比例逐渐增加, 到第17天时比例达最高, 为4.71%; 由于胸腺细胞总数随发育不断增加, 因此cd4+cd25+细胞数量在第18天时最多, 为5.87×105, 而此时胸腺细胞中其比例下降为3.91%。与体内胸腺细胞发育规律类似, 体外结果显示: 随培养时间的增加, 胸腺细胞中cd4+cd25+的比例和数量逐渐增加, 到第4天时胸腺细胞中cd4+cd25+的比例为10.85%, 达最高, 细胞数为4.31×104, cd4+cd25+占cd4+细胞的17.78%, 约占cd25+细胞的一半; 到培养的第6天, cd4+cd25+的比例下降, 但细胞总数达最高, 为4.89×104, 占cd25+细胞的80.06%。同时, 结果显示cd4+cd25+占cd4+细胞的比例体内、 外表现出不同步性, 可能是因为cd4+cd25+这群细胞的来源具有异质性的原因。另外的研究也显示cd4+cd25+双阳性t细胞实际上来源于2个群体: 首先在胸腺发育早期, 胸腺细胞表现为cd4-cd8-双阴性, 此时有57.07%的胸腺细胞为cd25+, cd4+cd25+双阳性t细胞可能来自于早期的双阴性t细胞, 即先出现cd25表型而后出现cd4表型。随着发育的成熟, cd4+t细胞增多, cd25+胸腺细胞减少, 另一部分cd4+cd25+双阳性t细胞可能是先有cd4表型, 而后出现cd25表型, 经历一个cd25+到cd25-再到cd25+的转变过程, 最终发育成cd4+cd25+双阳性t细胞, 该2群cd4+cd25+是否都发育成具有抑制功能的treg细胞有待于进一步的研究。在以上实验的基础上, 进一步观察了ccl20对cd4+cd25+胸腺细胞发育的影响, 结果显示ccl20下调cd4+cd25+的表达, 且与ccl20的浓度存在剂量依赖关系, 有文献报道il10可以诱导ccr6的表达[14], ccl20下调这群细胞的表达是否和他受体的表达有关有待于进一步的研究, 这些数据可能为胸腺cd4+cd25+发育和调控的研究提供一个新的依据。
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