【关键词】 组蛋白脱乙酰基酶类；血管紧张素ⅱ；心肌
abstract：objective:to observe the inhibitory effect of histone deacetylase 2-antisense oligonucleotide on cardiocyte hypertrophy induced by angiotensin ⅱ.methods:the cultured cardiocytes divided into control group,fugene group(treated with angⅱ and fugene),cardiocyte hypertrophy group(treated with angⅱ to induce hypertrophy),hdac2-asodn group［given with histone deacetylase 2(hdac2)-antisense oligonucleotide(asodn） and angⅱ］and hdac2-missence oligonucleotide(msodn) group(given with hdac2,msodn and angⅱ).the morphologic changes of cardiocytes were observed under the contrast phase mrna levels of hdac2 and β-mhc were examined by realtime pcr protein expressions of hdac2 and cfos,was examined by immunohistochemistry s:compared with control group,the cardiocytes enlarged（p<0.01） under the contrast phase microscope;the mrna levels of hdac2 and β-mhc and the protein expressions of hdac2 and cfos increased（p<0.01） in hypertrophic cardiocytes;but given by hdac2-asodn,these indexes decreased（p<0.05）.there was no significant difference among fugene 6 group and cardiocyte hypertrophy group and hdac2-msodn sion:the results means that hdac2 may play a role in genesis of cardiocyte 2 asodn may be a new drug to treat cardiocyte hypertrophy.
author′s address：the second affiliated hospital of harbin medical university，harbin,heilongjiang,150086,china
key words：histone deacetylases；angiotensin ⅱ；myocardium 多种疾病伴有心肌细胞的肥大，而且多种生理、病理性刺激因素也可以导致心肌细胞的肥大。目前已经认识到心肌细胞的肥大与基因转录的调控异常、胚胎基因的异常表达有关。近年来国外有学者发现，对基因转录有重要影响的ⅰ类组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylases,hdacs）与心肌细胞肥大有关，但国内对其研究甚少 ［1,2]。本实验利用血管紧张素ⅱ造成心肌细胞肥大，采用fugene 6转染组蛋白脱乙酰基酶2（histone deacetylases 2,hdac2）-反义脱氧寡核苷酸(antisense oligonucleotides,asodn)，以观察心肌细胞肥大过程中hdac2的表达情况。
1 资料与方法
1.1 fugene 6转染反义脱氧寡核苷酸 按照fugene 6（瑞士roche公司）说明书进行操作。于无菌试管中预先放入97μl无血清培养液，加入3μl的fugene 6，形成a液，室温下孵育5 min。a液中加入hdac2-错义脱氧核苷酸2μg形成b液，或加入hdac2-反义脱氧寡核苷酸 2μg形成c液，混匀后均于室温下孵育30 min。hdac2错义脱氧核苷酸序列为5′-tct atg gct agt gag tga gct a-3′；asodn序列为5′-gatgggaaggagagcagcacag-3′，由北京奥科公司合成。
1.2 心肌细胞培养 取生后2～3 d wistar乳鼠（由哈尔滨医科大学实验动物中心提供）心脏，放入一含无血清dmem培养液的平皿中。去除心房及心包膜、附属大血管后，0.25% 胰酶反复消化、取上清，将收集的上清液用2 000 r/min离心10 min。弃上清，在离心管中加入含10% 胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）的dmem（美国hyclone）高糖培养液，将细胞重悬，细胞计数。按细胞数2×105/ml接种于6孔板,细胞分为对照组、fugene 6组、肥大组、反义组和错义组。60 h后换无血清培养液。同时在对照组和肥大组细胞中加入100 μl无血清培养液；fugene 6组加入a液；错义组加入b液；反义组加入c液。继续培养6 h后肥大组、fugene 6组、错义组和反义组均加入10-5 mol/l血管紧张素ⅱ（angⅱ，终浓度为2×10-7 mol/l）。至此总结分组为：对照组（心肌细胞不肥大），肥大细胞组（单纯心肌细胞肥大），fugene 6组为肥大组+fugene，错义组为肥大组+b液，反义组为肥大组+c液。于37℃，5%co2 培养箱内继续培养12 h。各组均备复孔，其内预先放置无菌细胞培养玻片。
1.3 荧光显微镜下观察脂质体转染情况 取出玻片，用磷酸盐缓冲液（pbs）冲洗，冷丙酮固定后于荧光显微镜下观察。
1.4 相差显微镜下观察细胞面积变化 各组均随机选取10个视野，每个视野随机选取10个心肌细胞，在1600倍下应用motic images1.3软件测量心肌细胞面积，计算平均值。
1.5 逆转录聚合酶链反应（rt-pcr）检测hdac2和β-肌球蛋白重链（β-mhc） mrna表达 以trizol 液(invitrogin公司产品)提取心肌细胞中的总rna,用紫外分光光度计测总rna纯度和含量，按照takara rt-pcr试剂盒（takara公司）说明书进行操作。引物由北京奥科公司合成。hdac2基因引物序列：上游：5′-gct cga tgt tgg acg tat gag ac-3′；下游：5′-acc tcc ttc acc ttc atc ctc ag-3′；扩增片段长度为364 bp。β-mhc基因引物序列：上游：5′-accaagcagccacgccagta-3′；下游：5′-tgctttgcctttgcccttgt-3′，扩增片段长度为596bp。β肌动蛋白（β-actin)基因引物序列：上游：5′-ttg taa cca act ggg acg ata tgg-3′；下游：5′-gat ctt gat ctt cat ggt gct agg-3′；扩增片段长度为764 bp。逆转录条件：42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min，4℃保持。pcr反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 70 s，共进行30个循环；72℃ 7 min，4℃保持。pcr产物经1%琼脂糖电泳，经紫外透射分析拍摄电泳条带。以β-actin为内参照，结果以hdac2/β-actin、β-mhc/β-actin比值表示。
1.6 免疫组化法检测hdac2蛋白表达 取出各组无菌细胞培养玻片，无菌冷丙酮固定20 min。置于0.3% h2o2中30 min抑制内源性过氧化物酶。加入一抗(兔多克隆抗体hdac2,购自美国santa cruz公司)4℃过夜。加入二抗，室温下2 h。3-3′氨基联苯（dab）显色。苏木素复染。乙醇脱水，二甲苯脱乙醇，封片。镜下观察，hdac2以细胞核棕黄色为阳性。采用镜下随机选取10个视野，分别计算hdac2表达阳性心肌细胞的百分数。
1.7 统计结果 检测结果以均数±标准差 (±s)表示，采用spss 12.0软件包进行单因素方差分析，p<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 荧光显微镜下观察脂质体转染情况 转染18h后，于荧光显微镜下可见荧光标记的hdac2-反义寡核苷酸（图1，见封四）。
2.2 心肌细胞面积检测结果 各组心肌细胞面积与对照组相比，差异均有显著性（p<0.05～<0.01）。fugene 6组、错义组与肥大组相比，差异无显著性（p>0.05）。反义组与肥大组相比差异有显著性（p<0.05）。心肌细胞面积检测结果如表1。
2.3 rt-pcr检测hdac2/β-actin、β-mhc/β-actin结果 hdac2/β-actin、β-mhc/β-actin表达：各组与对照组相比，差异均有显著性（p<0.05～<0.01）；fugene 6组、错义组与肥大组相比，差异无显著性（p>0.05）；反义组与肥大组相比差异有显著性（p<0.05）；见表2。 表1 心肌细胞面积检测结果 注：与对照组相比△p<0.05，△△p<0.01；与肥大组相比▲p<0.05。下表同。表2 逆转录聚合酶链反应检测结果 注：hdac2：组蛋白脱乙酰基酶2；β-actin：β肌动蛋白；β-mhc：β-肌球蛋白重链。
2.4 免疫组化检测结果 hdac2阳性心肌细胞百分数，cfos阳性心肌细胞数：各组与对照组相比，差异均有显著性（p<0.05～<0.01）。fugene 6组、错义组与肥大组相比，差异无显著性（p>0.05）。反义组与肥大组相比差异有显著性（p<0.05），见表3。 表3 免疫组化检测阳性心肌细胞百分数
3 讨 论
hdac2可促进心肌细胞肥大：本次实验中利用angⅱ刺激心肌细胞可以造成心肌细胞肥大的体外模型，心肌细胞受到angⅱ刺激后，在显微镜下可见心肌细胞面积明显增大，在这一过程中，hdac2 mrna和β-mhc mrna表达均增加；同时hdac2蛋白和c-fos蛋白表达均增加。 核心组蛋白的乙酰化与去乙酰化是基因表达过程中重要的调控方式之一，成为目前众多科学家和学者研究的热点［1]。一直以来人们关注着hdacs在肿瘤病变中的作用，仅在近年来国外有少数学者初步发现：在心肌肥厚过程中hdacs有可能发挥着一定的作用［2]。根据hdacs与三种酵母蛋白的相关联性，hdacs可分为三类［3]。其中ⅰ类hdacs被认为可促进心肌细胞的肥大。 kee hj等人利用angⅱ及主动脉结扎法造成大鼠心肌肥厚，并给予非选择性hdacs抑制剂如曲古抑菌素（tsa）及选择性ⅰ类hdacs 抑制剂——sk-7041。结果发现应用以上抑制剂后可明显减轻心肌肥大，同时可提高心肌肥厚鼠的存活率。结合先前研究成果——ⅱ类hdacs在心肌细胞肥大过程中发挥一定的抑制作用，这说明抑制hdacs的作用、尤其是抑制ⅰ类hdacs的作用可预防心肌细胞肥大，从而证实了ⅰ类hdacs的促心肌细胞肥大作用［4]。同时也提示了在心肌细胞肥大过程中，ⅰ类hdacs的促心肌细胞肥大作用要强于ⅱ类hdacs的抑制心肌细胞肥大作用，从而为临床上治疗心肌细胞肥大提供了一条新的思路。 yingying zeng等人运用荧光原位杂交法确定了大鼠hdac2基因位于染色体10b1。同时发现hdac2转录蛋白具有一个突出特点：它包含了一些潜在的转录因子结合位点，而且这些转录因子大多与生长有关。例如，hdac2基因启动因子中含有一个ap1(active protein1，即激活蛋白1，一种细胞核内转录因子，主要由fos、jun、atf蛋白家族组成)结合位点，可与jun、jun b、fos和fos相关抗原结合，从而参与细胞的增生。这表明hdac2 mrna有可能被一些生长因子所激活［6］。 scott c等人研究发现，①hdac2可能是处于信号传导途径的下游，有可能是在染色体翻译修饰后对于转录进行的一种快速调节；②hdac2与蛋白之间的相互作用很有可能是通过磷酸化过程来进行调控的；③hdac2的磷酸化状态是与细胞周期相关的，可以想象hdacs的活动增加可能介导着有丝分裂过程中的转录静止或染色体浓缩。 ［7，8]这一现象提示：hdac2有可能在维持代谢平衡、调控细胞周期和肿瘤的形成中发挥着一定作用。 反义dna技术，就是采用一段人工合成的能与rna或dna互补结合的特异寡核苷酸,使其专一性地抑制基因的表达。一方面设计合成寡脱氧核苷酸，掺入基因组特异区域形成三股螺旋dna（triplex dna）、d环（d loop）或对转录因子的套圈作用，从而在复制或转录水平上抑制或封闭靶基因的表达；另一方面反义寡核苷酸则能与mrna形成dna·rna双链结构激活细胞内固有的核糖核酸酶h(rnase h)，特异降解杂交体中的mrna从而十分有效地阻滞mrna的翻译。 利用fugene 6可将hdac2-反义脱氧寡核苷酸成功转染入心肌细胞：本次试验中，利用fugene 6成功地将hdac2反义脱氧寡核苷酸转染入心肌细胞。fugene 6是非脂质体的转染试剂，通过加入的创新性组分，在增加核酸稳定性的同时，提高转染试剂－dna复合体穿越细胞膜的效率；这一过程速度的提高，预示着将整个转染过程对正常细胞生理功能的影响减到最小，而这些优势是阳离子脂质转染试剂所不能达到的。fugene 6转染试剂可应用于大片段质粒dna（>12 kb）、寡聚核苷酸剂及核苷酸的稳定或短暂表达转染方面的研究，而且可转染的原代细胞株及已建立的细胞系范围广泛。同时fugene 6的操作简便，不需要特殊的优化过程，大大减少了试验中的操作步骤。 本试验中利用fugene 6将hdac2-asodn转染入心肌细胞，实验结果表明，hdac2-asodn可以抑制hdac2的表达，同时也可抑制心肌细胞的肥大。这说明了hdac2参加了心肌细胞的肥大机制，同时也提示了hdac2-asodn可能是治疗心肌肥大的一条新途径。 前景：目前对于心肌细胞肥大机制的研究正在逐渐深入，hdacs的作用也越来越受到人们的关注。但是仍有许多问题有待于解决，其具体的作用过程尚未清楚，hdacs也有可能与其他多种传导通路相关联。希望本次实验能够为心肌肥大的发病机制的研究提供一条新的思路，尤其是反义寡核苷酸抑制心肌细胞肥大的作用应该受到重视，以期有助于临床上对多种疾病的治疗。
【参考文献】
[1]antos cl,mckinsey ta,dreitz m，et |dependent blockade to cardiomyocyte hypertrophy by histone deacetylase inhibitors［j］.j biol chem，2003，278(31):28930-28937.
［2]kee hj,sohn js,nam ki，et tion of histone deacetylation blocks cardiac hypertrophy induced by angiotensin ⅱ infusion and aortic banding［j］.circulation,2006 113(1):51-59.
［3］汤 屹，刘文励，周剑锋.组蛋白去乙酰化酶抑制剂治疗肿瘤的机制［j］.中华血液学杂志,2002,6(23):329-331.
［4］zhang cl,mckinsey ta,chang s,et ⅱ histone deacetylases act as signal|responsive repressors of cardiac hypertrophy［j］.cell,2002,110(4):479-488.
［5］starksen nf,simpson pc,bishopric n，et c myocyte hypertrophy is associated with c|myc protooncogene expression［j］.proc natl acad sci usa,1986,83(21):8348-8350.
［6］zeng y,tang cm,yao yl,et g and characterization of the mouse histone deacetylase-2 gene［j］.j biol chem,1998,273(44):28921-28930.
［7］tsai sc,seto tion of histone deacetylase 2 by protein kinase ck2［j］.j biol chem,2002,277(35):31826-31833.
［8］galasinski sc,resing ka,goodrich ja,et atase inhibition leads to histone deacetylases 1 and 2 phosphorylation and disruption of corepressor interactions［j］.j biol chem,2002,277(22):19618-19626.
［9］唐 琳，张云汉.反义核酸技术与肿瘤研究［j］.河南大学学报(医学版)，2005,24(2):24-27.
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