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蜈蚣抗癌实例(蜈蚣对肿瘤有什么作用)

2022-11-09  本文已影响 425人 
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第一篇:蜈蚣提取物抗肺癌活性的体内外实验研究


  肺癌已成为全球严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤,其发病率和病死率位居首位[1]。肺癌属中医“肺积”“咳嗽”“积聚”等范畴。徐振晔认为本病最基本的病理机制是癌毒痰瘀胶结于肺部,实证多为毒聚、痰凝、气滞、血瘀[2]。刘伟胜提出肺癌发病基础是正虚,直接因素是癌毒,治宜扶正配以软坚散结、清化瘤毒[3]。胡国良认为,凡肿瘤皆邪气密结不散,属实证,主张攻补兼施,攻以峻猛攻毒散结,补以甘温补益[4]。虫类药抗肿瘤作用一直颇受关注,蜈蚣作为一种重要的虫类药物,其攻毒散结的功效在临床治疗肺癌中药复方配伍中应用广泛[5-6]。本实验对蜈蚣有效成分的分离纯化、抗肺癌活性进行了研究,现报道如下。


  1 材料与方法


  1.1 动物


  SPF级纯系BALB/C-nu/nu雄性裸小鼠30只,4~6周龄,体质量(20±3)g,重庆斯莱康动物药业有限公司,许可证号SCXK(湘)2009-0004。饲养于湖南中医药大学动物实验中心SPF级实验室。


  1.2 细胞株


  人肺癌A549细胞株,购于湘雅医学院细胞中心。用含12%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养基,置37 ℃、5%CO2饱和湿度的恒温孵育箱中培养。


  1.3 药物及制备


  少棘蜈蚣,湖南中医药大学第一附属医院药剂科,提取物制备参照文献[7]方法改进。蜈蚣超微粉末2 g,55 ℃蛋白酶酶解后,99 ℃水浴中灭活10 min,4 ℃、5000 r/min离心10 min,取上清液,2倍体积预冷丙酮沉淀,4℃、5000 r/min离心10 min,取沉淀,超纯水充分溶解沉淀,重复2次。收集最后沉淀,超纯水溶解,加2倍体积预冷丙酮,取沉淀,30 ℃真空干燥成粉末,-20 ℃冻存备用。顺铂,齐鲁制药有限公司,批号5110351DB。


  1.4 主要试剂及仪器


  高糖DMEM培养基(美国GIBCO公司),FBS(美国INVITROGEN公司),磷酸盐缓冲液(PBS,武汉博士德有限公司),二甲基亚砜(DMSO,美国AMRESCO公司),噻唑蓝(MTT)、Hoechst33342荧光染料(美国SIGMA公司)。CO2培养箱(美国Therrmo公司),Elx808型酶标仪(美国BioTek公司),BX20型荧光显微镜摄像机(日本Olympus公司),FACScan型流式细胞仪(美国BD公司)。


  1.5 细胞增殖抑制率测定


  取对数生长期A549细胞制成单细胞悬液,调整浓度为5×104个/mL,接种于96孔板,每孔200 μL,蜈蚣提取物干预设置7个浓度梯度(2.500、1.250、0.625、0.313、0.15、0.078、0.039 mg/mL),同时设对照组和空白组(调零孔),均设5个复孔,其中对照组接种细胞加入完全培养基,空白组只加入完全培养基。MTT法检测参照说明进行,计算细胞生长抑制率(%)[1-(OD值药物组÷对照组OD值)]×100%,采用直线回归方程计算半数抑制率(IC50)。


  1.6 细胞凋亡及细胞周期检测


  取对数生长期A549细胞,浓度为1×105个/mL,接种于6孔培养板中,设置蜈蚣提取物组和对照组,其中蜈蚣提取物组加入IC50浓度药液处理,对照组加入等量完全培养基,每孔2 mL。蜈蚣提取物处理48 h后流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期。Hoechst荧光染色观察细胞凋亡形态。


  1.7 人肺癌裸小鼠皮下移植瘤模型制备


  取对数生长期A549细胞,浓度为1×107个/mL,接种于裸小鼠背部皮下,每只0.2 mL,接种后第7日成瘤。将30只裸小鼠随机分为模型组、蜈蚣提取物组、顺铂组,每组10只。接种后第8日给予药物灌胃,动物给药量按人和动物体表面积折算为成人5倍剂量。取蜈蚣提取物12 mg加入生理盐水至8 mL,配成含0.06 g原药材/mL药液,每次灌胃0.4 mL/只,2次/d;顺铂组予2 mg/kg剂量腹腔内注射,1次/3 d;模型组予等剂量生理盐水灌胃。连续18 d。各组小鼠治疗后第19日脱颈处死。实验过程中观察动物一般的状况,绘制肿瘤体积增长曲线并计算其抑瘤率。抑瘤率(%)=(模型组平均瘤质量-治疗组平均瘤质量)÷模型组平均瘤质量×100%。


  1.8 统计学方法


  采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示,2组间比较采用成组t检验;多组比较采用方差分析,组间比较采用SNK法。P<0.05表示差异有统计学意义。


  2 结果


  2.1 一般情况


  蜈蚣提取物组动物给药期间饮食、精神可,对外界刺激反应灵敏,大小便正常;顺铂组给药后第4日出现饮食减少,精神尚可,对外界刺激反应尚灵敏,大便稍溏,小便正常;模型组第3日后开始出现消瘦,精神欠佳,对外界刺激反应不灵敏,饮食饮水量减少,大便溏,小便正常。


  2.2 蜈蚣提取物对人肺癌A549细胞增殖抑制、细胞周期及诱导凋亡的影响


  MTT法检测结果显示,蜈蚣提取物对人肺癌A549细胞增殖有明显抑制作用(P<0.05),呈剂量依赖性。蜈蚣提取物增殖抑制率回归方程为:Y=24.807X+35.174。经计算IC50为0.603 mg/mL。以IC50浓度蜈蚣提取物作用于人肺癌A549细胞48 h后,与对照组比较,G0/G1期细胞百分含量下降,S期与G2/M期细胞比例均升高(P<0.05)。Hoechst荧光染色结果显示,蜈蚣提取物处理后A549细胞出现核染色质浓缩、凝聚,密度升高,细胞核被致密浓染,出现颜色发白等特征性凋亡表现,见图1。流式细胞仪检测结果显示,蜈蚣提取物组可见大量细胞凋亡,凋亡率达63.48%。结果见表1。


  2.3 蜈蚣提取物对人肺癌A549细胞裸小鼠皮下移植瘤瘤体体积、质量及抑瘤率的影响


  灌胃过程中测量皮下移植瘤第8、16、25日体积,蜈蚣提取物组分别为(126.0±11.2)、(171.5±13.3)、(196.0±20.8)mm3,顺铂组分别为(113.7±8.9)、(134.5±9.1)、(183.8±13.5)mm3,模型组分别为(320.0±24.6)、(786.5±31.1)、(1912.5±56.4)mm3,蜈蚣提取物组和顺铂组皮下移植瘤体积生长速度较模型组明显减慢(P<0.01),见图2。给药18 d后,蜈蚣提取物组皮下移植瘤瘤体质量为(2.94±0.76)g明显低于模型组[(4.65±0.91)g](P<0.05);与顺铂组[(2.52±0.69)g]比较无明显差异;蜈蚣提取物组抑瘤率为36.77%较顺铂组45.81%比无明显差异。


  3 讨论


  蜈蚣是我国传统名贵中药材,现代药理研究显示,蜈蚣具有降低血黏度、抗炎、抗菌、镇痛、抗惊厥等多种作用[8]。蜈蚣具有“攻毒散结”的功效特点,以复方配伍的形式应用于恶性肿瘤的临床治疗[9-12]。


  本研究对蜈蚣抗肺癌活性进行系列体内外实验,结果表明,蜈蚣提取物呈剂量依赖性抑制人肺癌A549细胞增殖,对肺癌细胞周期的影响主要表现为明显的G2/M期阻滞作用,使细胞有丝分裂受阻,阻碍DNA合成,促使其凋亡。体内裸小鼠皮下移植瘤实验结果也提示,蜈蚣提取物能减缓肿瘤生长速度,抑瘤率达36.77%,其疗效与顺铂45.81%比较差异无统计学意义。


  综上所述,蜈蚣提取物体外可抑制肺癌细胞A549的增殖并诱导其凋亡,体内可抑制皮下移植瘤的生长速度,显示蜈蚣具有良好的抗肺癌活性。


  参考文献:


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  中国中医药信息 2016年5期 作者:陈园 艾小佳 王志琪 田莎 周青 裴刚 田雪飞

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