作者：王晓丽，钟民涛，李星云，曹婧，宁安红，黄敏
【摘要】 目的构建香菇c91-3 cdna文库。方法低速离心法收集香菇c91-3菌丝体发酵液中的菌丝，提取总rna，巢式pcr扩增5srrna非转录间隔区2片段并测序鉴定。纯化mrna，以mrna为模板进行反转录反应；产物与pbluescript ii sk（+）载体连接，并转化 dh10b，检测库容及插入片段。结果香菇c91-3cdna文库初始库容为7.2×106cfu，插入片段长度0.4～3.4kb，平均1.5kb。结论成功构建香菇c91-3 cdna文库，适合用于研究香菇蛋白的编码基因。
【关键词】 香菇； cdna文库； 5srrna非转录间隔区2； 距离树； 库容
香菇作为一种常用的药用真菌在预防、治疗恶性肿瘤方面都具有重要价值，其多糖提取物主要为β-1,3键连接主链和β-1,6键连接支链的葡聚糖，能够提高机体免疫功能，间接抑制肿瘤的生长［1，2］，具有突出防癌抗癌、提高免疫力及缓解化疗反应等作用［3，4］，现已正式被作为辅助化疗药物应用于临床，香菇也被我国列为抗癌资源植物［5］。
香菇的生长周期为2～3个月，而生物发酵法培养7～10 d即可收获，大大缩到了试验周期，并且发酵液中的多糖及氨基酸成分与报道中香菇子实体的分析结果一致。因此，多年来本课题组一直以香菇发酵液蛋白为研究对象。前期研究证实，香菇c91-3菌株发酵液具有直接抗肿瘤作用［6～10］。香菇c91-3发酵液蛋白提取物能够抑制多种肿瘤细胞生长，大大延长荷瘤动物的生存期并且显著改善其生存状态。目前关于香菇c91-3发酵液中抗肿瘤效应蛋白的研究已经取得阶段性成果，本研究以香菇c91-3发酵液为rna来源构建cdna文库，以便进行分子生物学水平的后续研究。
1 材料与方法
1.1 材料香菇c91-3菌种由大连医科大学微生物实验室保存。chroma spin+te-1000购自clontech公司。克隆载体pbluescript ii sk（+），pmd19-t；宿主细菌 dh10b， dh5；rnaiso plus，oligotex-dt30 mrna purification kit ，cdna library construction kit， ex taq hot start version，修饰酶，dna marker等试剂以及pcr引物均来自takara大连公司。氨苄青霉素，x-gal，iptg，琼脂糖，胰化蛋白胨，酵母提取物购自大连晨钰生物试剂公司。其它试剂由大连医科大学提供。
1.2 rna提取及来源检验香菇c91-3发酵液100ml无菌纱布过滤除渣后，低速离心集菌。沉淀研磨后加入takara rnaiso plus 10ml，继续研磨至溶液透明，加入2ml氯仿抽提。加入预冷的无水乙醇，高速离心后depc处理水溶解沉淀。根据香菇5srrna基因间非转录间隔区2（igr2）序列（gi：5688862），设计巢式pcr引物。1-上游引物：5‘-aca tga cca aac aaa ccc ct-3’，1-下游引物5‘-cta agc cca agc aac cac tg-3’；2-上游引物：5‘-atc tag ctc gtt gaa ggg ga-3’，2-下游引物5‘-ctt gac aat gcg ttc tac cg-3’；使用ex taq hs酶扩增（ 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min）。pcr产物与pmd19-t载体连接后测序。总rna溶液中加入等体积的oligotex-dt30 mrna purification binding buffer（2×），按takara操作手册纯化mrna。
1.3 cdna合成5 μg mrna为模板，按照takara cdna library construction kit操作手册进行反转录反应，合成的双链cdna的3‘端含有xhoi酶切位点。双链cdna两端连接ecori adaptor后，xhoi酶切。反应体系移入chroma spin+te-1000 column中，700 g离心5 min，收集管中即为大于400bp的双链cdna。
1.4 连接质粒载体质粒pbluescriptii sk（+）进行ecori/xhoi双酶切。60 μl纯化的cdna中加入200 ng开链pbluescriptii sk（+），2 800 u t4 dna ligase，12℃过夜连接。连接产物回收，溶于20 μl te。
1.5 cdna文库鉴定取0.5 μl重组质粒1∶10稀释，预冷的0.1 cm冲击槽加入1 μl稀释液及100 μl dh10b进行电转化，冲击条件1.5 kv，200 ω，25 μf；冰上加入预冷的soc培养基1 ml，全量回收后37℃振荡培养1 h。分别取1 μl培养液1∶100，1∶200，1∶500稀释，10 μl稀释液涂布于lb琼脂糖筛选平板（含x-gal 20 μg/ml，iptg 24 mg/ml，amp 100 μg/ml），37℃过夜培养。计算初始文库库容。取5 μl未稀释的培养物涂布于lb/amp平板，37过夜培养后，加入lb/amp液体培养基2 ml洗脱菌落并回收，计算初级文库滴度。
1.6 pcr检测插入片段随机挑取15个白色菌落，soc/amp培养基37℃过夜培养后，碱裂解法提取质粒，使用t7、t3引物进行pcr扩增。t7 引物：5'- taa tac gac tca cta tag gg-3'；t3引物：5'- attaaccctcactaaagggaa -3'；pcr条件：94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min。
2 结果
2.1 总rna提取2 μl总rna溶液琼脂糖凝胶电泳，eb染色后，紫外光下可见清晰5srrna，18srrna及28srrna条带（图1-1），28srrna亮度约为18srrna的2倍，rna完整。a260/a280=1.92，rna纯度较高，符合建库要求。
2.2 rna来源检验2 μl巢式pcr产物3%琼脂糖凝胶电泳，出现清晰的单一条带，长度约400 bp（见图2）。测序结果：5‘-atc tag ctc gtt gaa ggg gac cgg tgt att ctg gac tga gtt att gat ata tct gtc taa cag agc gta cta act tgg gat gaa tag tat caa gct gtt aac aaa gtg ttt tgc ttt gtg gct tac ttt gag tca agc tca tct acg agt ctt gca atg ttg aat gaa gtg gat tac ttg ctg ata gct aaa cct gtt gca ttt aat cat ttg aaa atc cgc cgc gac tgt gcg cgg tcc ttt gtc gac tgt gcc ggt tgt tgg tag ttt tct tcg aag att ttg ata ttt gtt gct gca gag caa caa gta gaa aga atc tag aat tgt gag aac ggg gaa caa ggt ggg ttg att gtg act tga cat ttg ctt gta tat ttc ggt aga acg cat tgt caa g-3’，长度404 bp。与ncbi数据库中香菇5srrna igr2序列吻合，二者一致性达98%（398/405），gaps =0（2/405），图3为ncbi以fast minimum evolution法生成的距离树。
2.3 mrna纯化经 oligotex-dt30 mrna purification kit处理后，取5 μl溶液电泳，如图1～2所示，rrna亮带基本消失。
2.4 cdna合成及短片段去除反转录得到的cdna经1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示cdna长度为0.5～3.4kb，呈smear分布，无特异性条带（图4）。
2.5 文库鉴定质粒pbluescriptii sk（+）连接产物即为香菇c91-3初始cdna文库，库容为7.2×106 cfu，重组率为97%。回收的洗脱菌液构成初级文库，初级文库滴度为3.5×105 cfu/ml。
2.6 插入片段鉴定图5为15个随机菌落pcr扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳结果，cdna插入片段的长度为0.4～3.4 kb，平均1.5 kb。
3 结论
本实验的rna来源为香菇c91-3发酵液，为排除杂菌污染，作5srrna保守区段的pcr鉴定，扩增得到的5srrna igr2片段与ncbi数据库中记录的香菇l54菌株吻合。距离树分析显示已知的担子菌类真菌5srrna igr2变异较大，毒伞蕈与扩增片段的一致性为79%，松口蘑为78%，双色蜡蘑为77%。可见，香菇与这3种担子菌在进化上有一定差异。
另外，在模板及插入片段的制备过程中，经过多次纯化，大大降低了基因组dna及cdna短片段的影响，因此，本文库质量较高，初始库容达到7.2×106 cfu以上，即使是单拷贝基因也可以在本文库中找到，完全符合筛选文库要求。
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