作者：吕慧英， 赵晨曦， 梁逸曾， 吴海
【摘要】 目的建立同时测定大黄药材中5种蒽醌类衍生物（芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚）含量的方法，优化大黄蒽醌的超声提取工艺。方法采用反相高效液相法，色谱柱：waters c18柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-0.01%磷酸溶液 (3∶5∶2)；柱温：25 ℃；流速：1.0 ml/min；检测波长：225 nm。结果5种游离蒽醌均具有较宽的线性范围且呈良好的线性关系（r2=0.998 7～0.999 7），平均回收率为92.79%～99.28%，日内精密度为0.65%～1.71%，日间精密度为2.52%～3.46%。结论该方法成功应用于大黄活性物质的提取工艺优化，根据所建立的方法测得的5种游离蒽醌含量，确定了大黄蒽醌的最佳超声提取工艺为：以70％乙醇为溶剂、料液比为1∶30 (g∶ml)、超声提取2次、每次提取20 min。
【关键词】 超声提取； 大黄； rp-hplc； 蒽醌
abstract：objectiveto develop a method for the simultaneous determination of five anthraquinone derivatives (aloe-emodin, rhein, emodin, chrysophanol and physcion) in rhubarb, and to optimize the ultrasonic extraction srp-hplc on a waters c18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used. the mobile phase was methanol-acetonitrile-0.01% phosphoric acid solution (3:5:2), at a flow rate of 1.0 ml/min, and the detection wavelength was 225 nm. resultsthe linear ranges of the five free anthraquinones were wide, showing good linear correlations with correlation coefficients (r2) of 0.9987 to 0.9997. the average recoveries were from 92.79% to 99.28%. while the intra-day and inter-day precision were 0.65%～1.71% and 2.52%～3.46%, sionthrough the contents of five anthraquinone derivatives obtained by the developed rp-hplc method, the optimum ultrasonic extraction conditions are determined as follows: using 70% etoh as extracting solvent, the sample is extracted two times and each time for 20 min by a ultrasonic processor, when the solid to liquid ratio is 1:30 (g/ml).
key words：ultrasonic extraction; rhubarb; rp-hplc; anthraquinones
大黄radix et rhizoma rhei为蓼科植物掌叶大黄rheum palmatum l.，唐古特大黄rheum tanguticum maxim. ex balf 或药用大黄rheum officinale baill的干燥根和根茎，味苦、性寒。临床研究证实，大黄具有抗衰老、降血脂、抗肿瘤和抗炎、泻下作用及抗菌性、止血性等多种生物学活性［1］。其主要有效成分为蒽醌类衍生物,包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚以及与葡萄糖结合成苷。5种蒽醌是大黄以及衍生中药大黄属［2］质量控制的基础。
大黄中蒽醌的分离和测定方法有薄层色谱法(tlc)［3］，高速逆流色谱法(hsccc)［4，5］，胶束电动毛细管色谱法(mekc)［6］，毛细管区带电泳法(cze)［7］，高效液相色谱法(hplc)［8］，加压毛细管电色谱(pcec)［9］。高效液相色谱正是以其稳定、可靠、高效的特点成为中药研究的最普遍和常用的分析方法。本文建立了同时测定大黄药材中5种蒽醌衍生物（芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚）含量的rp-hplc法，旨在确定大黄蒽醌的最佳超声提取工艺，同时可应用于大黄药材及其制剂质量的定量评价，为大黄药材的有效开发和利用提供依据。
1 仪器与材料
agilent 1100型高效液相色谱仪（四元梯度泵，dad检测器，hp chem station 色谱工作站，美国安捷伦科技），上海bransonsb2200超声波发生器，d1810c型电子分析天平（上海申生科技有限公司），r-201型旋转蒸发器（上海申生科技有限公司），万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)。
芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品购自中国药品生物制品检定所；四川产大黄药材购于湖南国杏中药饮片有限责任公司，经湖南中医药大学药学院中药鉴定教研室鉴定为正品。药材于40 ℃干燥、粉碎过40目筛，贮于干燥器中置暗处保存备用；甲醇、乙腈、磷酸均为江苏汉邦科技有限公司生产的色谱纯，二次蒸馏水，乙醇、醋酸乙酯、石油醚、正己烷等均为北京化工厂生产的分析纯试剂。
2 方法与结果
2.1 hplc-dad分析条件色谱柱为waters pah c18色谱柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm）；柱温：25℃ ；进样量：20 μl；流速：1.0 ml/min；检测波长225 nm。流动相为甲醇-乙腈-0.01%磷酸溶液 (3∶5∶2)。试样过0.45 μm的微孔滤膜后进行hplc分析。
2.2 标准溶液的配制
2.2.1 标准储备液精密称取5种对照品适量，加甲醇配制成含芦荟大黄素（135 μg/ml），大黄酸 （105 μg/ml），大黄素（90 μg/ml），大黄酚（90 μg/ml），大黄素甲醚(75 μg/ml)的标准混合储备液。于4 ℃下冷藏，备用。
2.2.2 工作标准液临用前精密吸取适量加甲醇配制成每1 ml分别含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚为13.5，10.5，9，9，7.5 μg的工作标准液。
2.3 样品溶液制备称取0.5 g 大黄细粉，用15 ml溶剂（正己烷、石油醚、氯仿、醋酸乙酯、丙酮、甲醇、80%甲醇、乙醇、70%乙醇、水）进行超声提取, 抽滤，滤液于40 ℃下真空旋转蒸发至干，后用甲醇溶解定容于10 ml容量瓶中，于4 ℃下冷藏，备用。
2.4 方法学实验
2.4.1 色谱分离在拟定的色谱条件下，得到芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚的标准色谱图(图1a) 以及大黄药材样品的色谱图(图1b) 。由图1可知，样品中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚与相邻组分的分离度rs>1.5 ,达到基线分离。
2.4.2 线性关系取混合标准储备液适量，用甲醇稀释成一系列不同浓度的标准溶液，分别进样3次，以标准溶液浓度x对峰面积y进行线性回归，各组分在各自浓度范围内线性关系良好。结果见表1。表1 5种标准品线性范围，线性方程和回归系数（略）
2.4.3 精密度考察精密度分为日内精密度和日间精密度。对同一工作标准液在日内连续进样5次，得日内精密度，结果测得峰面积的rsd为芦荟大黄素0.65%，大黄酸1.09%，大黄素0.98%，大黄酚1.39%，大黄素甲醚1.71%；在连续3 d内分别测定5次得日间精密度，结果测得峰面积的rsd为芦荟大黄素3.46%，大黄酸2.52%，大黄素3.26%，大黄酚3.15%，大黄素甲醚3.06%。
2.4.4 重复性考察在上述色谱条件下，对同一批样品按样品溶液的制备方法平行制备6份，分别进样20 μl，进样测定，按外标法测定含量并计算rsd，芦荟大黄素2.52%，大黄酸2.20%，大黄素2.10%，大黄酚2.07%，大黄素甲醚2.89%。
2.4.5 准确性（加样回收率实验）取已知含量的大黄药材细粉适量，精密加入对照品适量，振摇，其余按样品溶液的制备方法，在上述相同色谱条件下分别进样，按外标法测定其含量,计算加样回收率和rsd。结果见表2。表2 测定方法回收率结果（略）
2.5 方法的应用－最适超声提取工艺的确定称取0.5 g 大黄细粉，用50ml溶剂（正己烷、石油醚、氯仿、醋酸乙酯、丙酮、甲醇、80%甲醇、乙醇、70%乙醇、水）进行超声提取30 min, 抽滤，滤液于40 ℃下真空旋转蒸发至干，后用甲醇溶解定容于10 ml容量瓶中，于4 ℃下冷藏，备用。在上述色谱条件下对各提取液进行hplc分析，测定其中5种游离蒽醌含量。结果见表3。表3 溶剂对游离蒽醌提取率的影响（略）
表3结果表明，正己烷等低极性溶剂提取大黄游离蒽醌效率低，而甲醇，乙醇提取率高，在水中提取效率很低，且提不出大黄酸，这是因为其在水中溶解性小。大黄游离蒽醌中的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素在以80%甲醇作为提取溶剂时，提取率最高；大黄酚、大黄素甲醚在以甲醇作为提取溶剂时，提取率最高；游离蒽醌提取效率次高的为70%乙醇。考虑到甲醇有毒，不宜用于食品和药物的加工，而乙醇从自然得来，成本低等诸因素，我们认为70%乙醇最合适。
以70%乙醇为提取溶剂，其他条件不变，考察不同超声提取时间（10，20，30，40，60 min）对5种游离蒽醌提取率的影响：芦荟大黄素、大黄酸、大黄素在20 min时提取率最高（2.092，2.913，2.497 mg/g），大黄酚、大黄素甲醚在40 min提取率最高（5.069 mg/g、1.294 mg/g），在20 min时次之（5.042 mg/g，1.286 mg/g），综合考察选择20 min为提取时间。
以同样的方法，分别考察了不同料液比（1∶5，1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 g/ml）以及超声提取次数对提取效率的影响。结果显示，5种大黄游离蒽醌在1∶30料液比时提取效率最高；超声提取两次最为合适。
3 结论
本文建立了同时测定大黄药材中5种蒽醌类衍生物（芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚）含量的rp-hplc法，该方法测定5种游离蒽醌的日内和日间精密度rsd分别在0.65%～1.71%和2.52%～3.46%之间，准确度高；回收率在92.79%～99.28%之间；具有宽线性范围和良好的线性关系（r2在0.998 7～0.999 7之间）。所建立的方法应用于大黄活性物质的提取工艺优化，确定了大黄蒽醌的最佳超声提取工艺为：以70％乙醇为溶剂、料液比为1∶30 (g∶ml)、超声提取2次、每次提取20 min。本实验为大黄的进一步研究和开发奠定了良好的基础。
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