作者：陈秀珍，朱大诚，王艳辉，尹小明
【摘要】 目的研究白花蛇舌草对白血病cem细胞的抑制作用及其机制。方法采用mtt比色实验检测白花蛇舌草对cem细胞的抑制率；光镜、电镜技术观察细胞凋亡形态结构的改变；流式细胞术（fcm）检测细胞凋亡率。结果白花蛇舌草能明显抑制cem细胞的生长，药物浓度在0.025 6 μg/ml即具有显著的抑制作用，抑制率呈剂量和时间依赖性，半数抑制浓度（ic50）约为0.128 μg/ml；光镜、电镜下见细胞体积缩小，细胞膜皱缩，染色质明显浓缩，核聚集，边聚于核膜下呈新月形等典型的凋亡特征；流式细胞术证实白花蛇舌草能诱导cem细胞凋亡，凋亡率也呈剂量和时间依赖性。结论白花蛇舌草对白血病cem细胞的生长具有明显的抑制作用，诱导细胞凋亡是其机制之一。
【关键词】 白花蛇舌草； 白血病； cem细胞； 生长抑制； 细胞凋亡
白花蛇舌草hedyotis diffusa wilid为茜草科一年生草本植物白花蛇舌草的全草。在我国主要分布于南方各省区，夏秋季节采收，洗净，鲜用或晒干。其味微苦、微甘，性凉，入心、肝、肺经，具有清热、解毒、利湿、抗癌等功效。
近年来许多学者对白花蛇舌草进行了广泛的研究，特别是其抗肿瘤作用的报道较多，但其对白血病作用的研究较少［1，2］。为此，我们以白花蛇舌草作用人t淋巴细胞白血病cem细胞株，研究白花蛇舌草抑制白血病cem细胞株的机制。现报道如下。
1 材料
白花蛇舌草由江西药都樟树中药饮片有限公司生产，批号20080701。将白花蛇舌草高速粉碎成碎片状，浸泡于盛有10倍量药材的蒸馏水的圆底烧瓶中12 h后，煎煮3次，收集滤液进行抽滤浓缩，将浓缩液置于旋转蒸发器中，滤液蒸发成粉末，再将粉末准确称重并溶于三蒸水，滤过除菌，配成浓度为220 mg/ml的白花蛇舌草水提液备用。噻唑蓝（mtt）、二甲基亚砜（dmso）为sigma公司产品，rpmi1640为gibco公司产品，小牛血清（fbs）为杭州四季青生产，凋亡检测试剂盒为北京保赛生物技术有限公司生产。
2 方法
2.1 细胞培养白血病cem细胞株本实验室保存。培养基为含体积分数为10%的fbs的rpmi1640，并加入双抗（青霉素100 u/ml和链霉素100μg/ml）。在37℃、5% co2、饱和湿度的培养箱（therno forma公司产品）中培养。取对数生长期细胞进行实验。
2.2 mtt比色实验将cem细胞悬液离心（1 500 r/min、8 min），台朌蓝拒染法进行细胞计数，调整细胞终浓度为3×105/ml进行实验，将细胞悬液接种于96孔培养板，每孔190 μl，24 h后，实验组分别加入6种不同浓度的白花蛇舌草溶液（终浓度分别为0.005 12，0.025 6，0.128，0.64，3.2，16 μg/ml）10 μl，对照组不加药，微振荡，另设空白组（只有培养基，无细胞）每组6个复孔，培养于3个时间段（24，48，72 h）后，每孔加mtt（5 mg/ml）20 μl，继续培养4 h后，离心（1 500 r/min、8 min），弃上清液，每孔加dmso 150 μl，避光微振荡，让甲臜溶解充分，置于自动酶标仪，测490 nm处的吸光度（a490）值。抑制率（%）=［（对照组a值-实验组a值）/对照组a值］×100%。
2.3 形态学观察白花蛇舌草作用于cem细胞时间和浓度同mtt比色实验，在倒置显微镜下观察实验组和对照组cem细胞的一般情况并照像；cem细胞悬液离心涂片，giemsa染色，油镜下观察细胞形态；取白花蛇舌草3个浓度（0.025 6，0.128，0.64 μg/ml）作用于cem细胞，两个时间段（24，48 h）后，制成超薄切片，在透视电镜下观察细胞超微结构及凋亡小体。
2.4 流式细胞术（fcm）分析白花蛇舌草3个浓度（0.025 6，0.128，0.64 μg/ml），作用于cem细胞两个时间段（24，48 h）后，细胞用pbs洗两遍，70%乙醇固定，重悬于pbs中调整细胞浓度为1×106/ml，取100 μl，加碘化吡啶（pi）1 ml，轻轻混匀置4℃冰箱30 min，上机检测（流式仪为 becton dtckinson，b.d公司产品），采用cenquest软件上机获取10 000个细胞，modfitlt软件分析并统计结果。
2.5 统计学分析采用双侧t检验 ，求p值。p＜0.05为差异有显著性。
3 结果
3.1 白花蛇舌草对白血病cem细胞生长的影响不同时间和剂量白花蛇舌草对cem细胞生长的影响见表1。0.025 6 μg/ml的白花蛇舌草即可显著抑制cem细胞生长，半数抑制浓度（ic50）约为0.128 μg/ml，从表1可见，白花蛇舌草对cem细胞的抑制作用具有时间和剂量依赖性，抑制率随剂量增高、时间延长而增大。表1 白花蛇舌草对cem细胞生长的影响（略）
3.2 细胞形态学变化
3.2.1 光镜在倒置显微镜下可见，对照组（见图1）细胞多且饱满，大小均一、有侧凸；实验组（见图2～3）细胞数量有所减少，细胞皱缩，体积变小、大小不一，且高剂量组大部分细胞已破碎（见图4），有坏死趋向。涂片，giemsa染色，油镜下可见，对照组（见图5）cem细胞着色深，大小基本一致，球形，核大，核浆比例失调等肿瘤细胞特征。实验组（见图6）cem细胞体积明显缩小，大小不等，核浓染，核浆比例失调；胞膜皱缩，结构不清，染色质疏松、粗糙（见图7）；有较多细胞的染色质凝集边聚成团块状、新月形等凋亡小体（见图8）。
3.2.2 电镜可见对照组（见图9）cem细胞圆或椭圆形，常染色质丰富，核大呈肾形，核仁大且清楚，胞浆内线粒体、容酶体和内质网丰富，细胞膜有微绒毛和伪足样突起。而白花蛇舌草处理组低浓度（见图10）时细胞体积缩小，核染色质凝聚，出现核碎片等早期细胞凋亡现象；有的细胞核膜已消失,许多凋亡小体融合成一个大的团块,胞浆内细胞器的结构消失（见图11）。随药物浓度增加，作用时间延长，凋亡细胞越多，凋亡特征越明显，并可见典型的新月形核的凋亡细胞（见图12），细胞器变性， 细胞膜不完整且变光滑，体积缩小。
3.3 流式细胞仪检测cem细胞凋亡情况白花蛇舌草诱导cem细胞凋亡率存在时间和药物浓度依赖性，随药物浓度的增加和时间的延长，凋亡率也增加（见表2 ）。表2 白花蛇舌草诱导cem细胞凋亡率
4 讨论
恶性肿瘤白血病已严重威胁人们的正常生活，甚至危及生命。白血病是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病，其克隆中的白血病细胞增殖失控，分化障碍，凋亡受阻，而停滞在细胞发育的不同阶段。在骨髓和其它造血组织中白血病细胞大量增生累积，并浸润其它器官和组织，而正常造血受抑制。目前白血病治疗主要采用药物、化疗和骨髓移植等3个方面。药物治疗白血病效果不甚理想，而且毒副作用多，抗白血病药物均有不同程度的骨髓抑制现象，在临床上导致出血，感染，心、肝、肾损害等而影响治疗。白血病的化疗虽有杀灭白血病细胞，解除白血病细胞的浸润作用，但同时也损伤了正常细胞及免疫功能。骨髓移植成功率不高，费用贵，且骨髓来源和配型困难，因此，白血病的治疗仍有许多问题急待解决。 20世纪60年代，kerr等［3］提出细胞凋亡的概念以来，许多学者的大量研究表明，肿瘤的发生不仅与细胞增殖异常有关，而且与细胞凋亡异常密切相关。正常情况下白细胞增殖与凋亡，两者维持动态平衡。而在发生白血病时，细胞增殖失控分化障碍，凋亡受阻，即增殖大于凋亡。如果某种药物能启动白血病细胞凋亡程序，诱导白血病细胞凋亡，那么白血病的治疗有望突破。因此，细胞凋亡已视为评估疗效的一项新指标［4］。
本实验结果显示，白花蛇舌草处理白血病cem细胞后，能显著抑制其生长。抑制率具有时间和剂量依赖性，随着作用时间的延长，药物剂量的增大，抑制率逐步提高。光镜显示，细胞体积缩小，核浓染，细胞数量与对照组比较大为减少。电镜证明，形态学呈现典型的凋亡特征性改变，核染色质凝集，沿核膜周边聚集呈新月形，胞膜内陷包裹变性的细胞内容物成凋亡小体，这些变化是确认细胞凋亡的十分可靠的方法［5］。流式细胞术进一步说明白花蛇舌草能诱导cem细胞凋亡。
应用中草药抗白血病作用的研究值得重视。其一，中草药成分复杂，生物学活性广，或许可以通过多途径多靶点而起到抗白血病的作用；其二，中草药毒副作用小，与化疗药物相比具有显著的优越性。例如，中药蟾酥在体内、外均有抗淋巴细胞白血病的作用，且能抑制l615白血病细胞对免疫系统的浸润就是很好的例子［6，7］。本研究证明白花蛇舌草也能显著抑制白血病cem细胞生长及诱导其凋亡。但从目前文献报道可知，中草药抗白血病作用的机制研究不够深入，以及体内抗白血病作用研究甚少。因此，白花蛇舌草诱导白血病cem细胞凋亡的分子生物学机制（如凋亡相关基因的表达）是今后研究努力的方向；在体内是否具有抗白血病作用，能否诱导多药耐药白血病细胞凋亡也有待研究。
【参考文献】
［1］陈秀珍，朱大诚，王艳辉．白花蛇舌草药理作用及临床应用研究新进展［j］．中药材，2009，32（1）：157．
［2］朱大诚，尹小明．白花蛇舌草抗肿瘤作用及其机制研究进展［j］．江西中医学院学报，2006，18（1）：74．
［3］kerr jfr，ｗyllie ah, currie ar．apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging implications in tissue kinetics［j］．br j cancer，1972，26:239．
［4］朱大诚，黄学明，尹小明，等．长春新碱对白血病cem细胞生长抑制及诱导凋亡作用的研究［j］．中国现代医学杂志，2007，23（17）：2852．
［5］thompson c b．apoptosis in the pathogenesis and treatment of disase［j］．science，1995，267：1456．
［6］朱大诚，尹小明，黄学明，等．蟾酥对白血病 cem细胞的抑制作用及诱导其凋亡的研究［j］．时珍国医国药， 2007，18（10）：2398．
［7］朱大诚，尹小明，陈秀珍，等．蟾酥对可移植性小鼠淋巴细胞白血病疗效的研究［j］．时珍国医国药，2007，18（11）：2645．
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