作者：魏丹丹，许琼明，孙晓飞
【摘要】 目的研究麦角甾醇及类似物7-脱氢胆甾醇氧化后的抗结核作用。方法从胶陀螺中分离得到麦角甾醇，对其氧化得到麦角甾醇过氧化物;并对麦角甾醇类似物7-脱氢胆甾醇进行氧化得7-脱氢胆甾醇过氧化物;用mtt法检测其氧化产物的抗结核活性。结果麦角甾醇过氧化物及其类似物的过氧化物当浓度分别超过20，50 μg/ml时有抗结核活性。结论麦角甾醇过氧化物及7-脱氢胆甾醇过氧化物具有一定的抗结核活性。
【关键词】 麦角甾醇; 过氧化物; 抗结核
abstract：objectiveto study the antituberculous activity of oxidative products of ergosterol and sergosterol was separated from bulgaria inquinants and oxygenized ;its analogue 7-dehydrodesmosterol was also oxygenized. the antituberculous activity of oxygenized products were detected using mtt s the oxidative products had antituberculous activity when concentration of ergosterol peroxide exceeded 20 μg/ml and the 7-dehydrodesmosterol peroxide exceeded 50 μsionthe oxidative products has invariably antituberculous activity.
key words：ergosterol; peroxidate; antitubercle
胶陀螺bulgaria inquinants (pers fr)，又名拱嘴蘑、胶鼓菌等，为子囊菌纲胶陀螺科胶陀螺属真菌，分布于我国东北长白山区，历代本草未见其有关药用记载。此菌有毒[1]，处理不当食用或食用过多后会出现日光过敏性皮炎型症状[2，3]。杨晓静等[4]发现胶陀螺可以明显抑制动物eac艾氏腹水及h22肝癌腹水的细胞生长，且使死细胞数明显增加，表明其具有一定的抗肿瘤作用。
结核病(tuberculosis)是由结核杆菌引起的一种慢性传染病，可侵及许多脏器，以肺部受累形成肺结核最为常见。我国的结核病耐药情况十分突出，耐药率高达46%，被世界卫生组织列入特别引起警示的国家和地区之一;部分病人由于对化疗药物过敏、耐药或有毒副作用，不能使用化疗药物或化疗药物对其失去作用[5]，而天然药物则可迅速改善结核患者的临床症状，提高疗效，缩短疗程，拮抗化疗毒副作用[6]。有 文献 报道[7]，从植物及海洋生物中提取的二萜类化合物、色胺酮及其类似物、香豆素类等天然活性成分也具有抗结核作用，国外学者akihisa t从食用蘑菇hypsizigus marmoreus中分出麦角甾醇等一系列甾醇化合物，并证明它们几乎都具有良好的抗结核杆菌和抗eb病毒的活性[8]。
本实验从胶陀螺中提取得到麦角甾醇，对其氧化得到麦角甾醇过氧化物，并对麦角甾醇类似物7-脱氢胆甾醇进行氧化得7-脱氢胆甾醇过氧化物;并用mtt法检测氧化产物的抗结核活性。
1 仪器与材料
1.1 仪器 旋转蒸发器(re-52a，上海亚荣生化仪器厂);循环水式真空泵(shz-da，巩义市英峪华仪器厂);电热恒温鼓风干燥箱(gzx-gf-9023-bs，上海博泰实验设备有限公司);显微熔点测定仪(xt-5，北京科仪电光仪器厂);超导核磁共振谱仪(unity-inova 300，美国瓦里安公司);质谱仪(tof-ms，英国 micromass公司)。
1.2 材料胶陀螺购于延吉市长白山特产品经营部;7-脱氢胆甾醇(纯度97%，sigma公司);柱层析硅胶和薄层层析硅胶g(80-120目)均为青岛海洋化工有限公司产品;显色剂：10%磷钼酸乙醇溶液;化学试剂均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司提供。middlebrook7h9培养基干粉和营养添加剂(oadc)均购自美国bd公司;应用液为含10%oadc 的middlebrook7h9液体培养基;受试菌株：结核分枝杆菌标准株h37rv，来自国家菌种保藏中心;dmso购自国药公司。
2 方法与结果
2.1 提取与分离胶陀螺干燥子实体4.60 kg， 70%乙醇溶液回流提取3次，每次3 h，合并提取液，浓缩后得到浸膏1.12 kg。将浸膏用适量的水分散，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇萃取。石油醚萃取部位经浓缩后得浸膏16.64 g，经硅胶柱层析，用石油醚-醋酸乙酯梯度洗脱，石油醚∶醋酸乙酯(90∶10)洗脱物经重结晶得白色针晶。mp160～162℃，李伯曼反应阳性，tlc的rf值与麦角甾醇对照品完全一致，混合熔点不下降。故确定白色针状结晶为麦角甾醇。
2.2 结构修饰
2.2.1 麦角甾醇过氧化物的制备麦角甾醇3 g和亚甲基兰0.5 g放于三口瓶中，加二氯甲烷30 ml使其溶解，通入氧气，并开始搅拌，在烧瓶旁放置碘钨灯，室温条件下过夜反应，tlc检测反应完全。反应液和柱层分析硅胶搅拌均匀，干法上样，氯仿-醋酸乙酯梯度洗脱，经减压柱vlc纯化得产品2.5 g。
麦角甾醇过氧化物
黄色针晶， mp：184～185℃，ir(kbr,cm-1)见图1:3 442.4(oh)、2 958.3、2 872.2、1717.8(c=c)、1 458.3、1 383.7[偕二甲基]、1 042.4、972.7(-o-o-);hrms:c28h46o3 见图2。430.3447,found: 430.3453;1h nmr(400 mhz，cdcl3) 见图3： δppm: 6.51(1h，d,j=8.4hz,h-7)，6.25(1h,d,j=8.4hz,h-6)，5.23(1h,dd,j=15.2、7.6hz,h-22)、5.14(1h,dd,j=15.2 、8.0hz,h-23)，3.97(1h,m, h-3);13cnmr(300 mhz,cdcl3) 见图4。δppm: 135.6(c-6).135.4(c-7)、132.4(c-23)、130.9(c-22)、82.3(c-5)、79.6(c-8)、66.6(c-3)、56.3(c-17)、51.8(c-9)、51.2(c-14)、44.7(c-13)、42.9(c-24)、39.9(c-20)、39.5(c-4)、37.1(c-10)、34.8(c-1)、33.2(c-25)、30.2(c-2)、28.8(c-10)、23.5(c-15)、21.0(c-27)、20.8(c-11)、20.1(c-26)、19.8(c-21)、18.3(c-19)、17.7(c-28)、13.0(c-18)。
2.2.2 7-脱氢胆甾醇过氧化物的制备同“2.2.1”项下方法制得黄色蜡状物。
ir(kbr,cm-1)见图5:3 402.4(oh)，2 927.2，2 869.2，1 647.7(c=o)，1 466.2，1 378.0 [偕二甲基]，1044.1，958.4(-o-o-);hrms(c27h44o3)见图6: 416.3290，found: 416.3309;1hnmr(400mhz,cdcl3) 见图7δppm:6.52(1h，d,j=8.4hz,h-7)，6.25(1h,d, j=8.4hz,h-6),3.97(1h,m,h-3);13c nmr(300 mhz,cdcl3)见图8δppm:135.5(c-6), 130.9(c-7) 、79.8(c-5)、79.6(c-8)、66.6(c-3)、56.6(c-17)、51.7(c-9)、51.2(c-14)、44.9(c-13)、39.6(c-20)、37.1(c-4)、36.1(c-10)、35.4(c-1)、34.8(c-25)、30.2(c-2)、29.9(c-12)、28.4(c-16)、28.2(c-15)、23.9(c-11)、23.6(c-24)、23.0(c-22)、22.7(c-23)、20.8(c-27)、18.7(c-26)、18.3(c-21)、14.3(c-19)、12.8(c-18)。
2.3 mtt法检测抗结核效果
2.3.1 方法活细胞能够还原黄色的溴化3-(4,5 -二甲基噻唑-2 )-2,5-二苯基四氮唑〔3-(4,5 - dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenylterazoliumbromide〕, 即mtt，一种四甲基偶氮唑盐，为蓝紫色的不溶于水的甲臜(formazan)，甲臜的生成量在通常情况下与活细胞数成正比。
mtt法是在液体培养基中加入抗结核菌药物和mtt，结核分枝杆菌的生长使培养基中的mtt还原成甲臜, 甲臜为紫色，不溶于水，以颗粒形式分布于细胞表面，使菌体变成紫色，用肉眼即可观察到，如果药物作用使得结核分枝杆菌生长受到抑制，则无紫色颗粒生成。
本法具有快速简便的特点，一般7 d可观察结果。
2.3.2 受试菌株的制备将受试菌株转入液体培养基于37℃培养2周，吸取培养菌液少许，置于4 ml液体培养基中，加入直径2～3 mm无菌玻璃珠10～20粒，振荡20～30 s，静止沉淀10～20 min，吸取菌悬液上清，用液体培养基调整比浊至1个麦氏单位，相当于1mg/ml备用。
2.3.3 待检物的准备待检物采用两组共11个药物浓度，分别为(6.25，12.5，25，50，100 μg/ml)和(0.625，1.25，2.5，5，10，20μg/ml) 。称取适量待检药，用2%dmso溶解成母液，用液体培养基稀释成10倍终浓度的工作液。
检测时各取上述工作液20 μl加入170 μl液体培养基中，再加入1 mg/ml浓度的待检菌液10 μl，对照组不加药。37℃ 7 d孵育后，每孔加入mtt溶液(5 mg/ml)10 μl。然后再孵育过夜。如果加入mtt后，有紫色沉淀出现，就在有沉淀的孔中加入50 μl的sds-dmf溶液，再孵育3 h。如果颜色从黄色变为紫色即预示着细菌生长。检测结果见表1～3。表1～2显示当麦角甾醇过氧化物浓度超过20 μg/ml，结核分枝杆菌不生长，有抗结核活性。表3显示当7-脱氢胆甾醇过氧化物的浓度超过50 μg/ml时，结核分枝杆菌不生长，有抗结核活性。
注h37rv菌株, inh mic为0.125 μg/ml, rfp mic为0.03 μg/ml, sm mic为0,25 μg/ml, eb mic为0.5 μg/ml。表1 mtt法对不同浓度下麦角甾醇过氧化物的检测结果表2 mtt法对不同浓度下麦角甾醇过氧化物的检测结果表3 mtt法对不同浓度下7-脱氢胆甾醇过氧化物的检测结果
3 讨论
目前，临床上应用的抗结核药物因长期使用和不合理用药已经产生了严重的耐药现象，而且已经有很多报道证实，常用的一线药物对肝脏毒性较大。为此，寻找和开发新的抗结核药物是目前临床研究的重要课题，应用mtt快速显色法检测麦角甾醇过氧化物对结核分枝杆菌标准毒力株h37rv具有抑制作用，其mic为20 μg/ml。7-脱氢胆甾醇过氧化物对结核分枝杆菌标准毒力株h37rv同样具有抑制作用，其mic为50 μg/ml。本实验结果表明，有必要对分子结构中含共轭双键的萜类化合物进行进一步的系统研究，并开发新型的抗结核药物。
【 参考 文献】
[1] 胡建友.胶陀螺中毒二例报告[j].北京医学,2002,24(3):216.
[2] 李茹光.东北大型食用、药用及有毒真菌[m].长春:东北师范大学出版社,1992:25.
[3] 包海鹰,李玉.胶陀螺的光敏活性研究[j].食用菌学报,2002,9(4):15.
[4] 杨晓静,张泓嵬.胶陀螺的抗肿瘤作用[j].特产研究，1993,2:10.
[5] 唐神结.耐多药结核病的化学药物研究进展[j].中华结核和呼吸杂志,2006,29(8):567.
[6] 林明贵,金关甫.耐药结核病及其对策[j].传染病信息,2005,18(1):4.
[7] 陈国良,谭国良,孙平华.抗结核药物的研究与开发[j].药学进展,2004,28(12):534.
[8] 魏 莉,许重远.食用蘑菇hypsizigus marmoreus中甾醇类和聚异戊二烯多羟基化合物的抗结核杆菌和抗eb病毒活性[m].国外医药·植物药分册,2006,21(3):125.
2.2.2 7-脱氢胆甾醇过氧化物的制备同“2.2.1”项下方法制得黄色蜡状物。
ir(kbr,cm-1)见图5:3 402.4(oh)，2 927.2，2 869.2，1 647.7(c=o)，1 466.2，1 378.0 [偕二甲基]，1044.1，958.4(-o-o-);hrms(c27h44o3)见图6: 416.3290，found: 416.3309;1hnmr(400mhz,cdcl3) 见图7δppm:6.52(1h，d,j=8.4hz,h-7)，6.25(1h,d, j=8.4hz,h-6),3.97(1h,m,h-3);13c nmr(300 mhz,cdcl3)见图8δppm:135.5(c-6), 130.9(c-7) 、79.8(c-5)、79.6(c-8)、66.6(c-3)、56.6(c-17)、51.7(c-9)、51.2(c-14)、44.9(c-13)、39.6(c-20)、37.1(c-4)、36.1(c-10)、35.4(c-1)、34.8(c-25)、30.2(c-2)、29.9(c-12)、28.4(c-16)、28.2(c-15)、23.9(c-11)、23.6(c-24)、23.0(c-22)、22.7(c-23)、20.8(c-27)、18.7(c-26)、18.3(c-21)、14.3(c-19)、12.8(c-18)。
2.3 mtt法检测抗结核效果
2.3.1 方法活细胞能够还原黄色的溴化3-(4,5 -二甲基噻唑-2 )-2,5-二苯基四氮唑〔3-(4,5 - dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenylterazoliumbromide〕, 即mtt，一种四甲基偶氮唑盐，为蓝紫色的不溶于水的甲臜(formazan)，甲臜的生成量在通常情况下与活细胞数成正比。
mtt法是在液体培养基中加入抗结核菌药物和mtt，结核分枝杆菌的生长使培养基中的mtt还原成甲臜, 甲臜为紫色，不溶于水，以颗粒形式分布于细胞表面，使菌体变成紫色，用肉眼即可观察到，如果药物作用使得结核分枝杆菌生长受到抑制，则无紫色颗粒生成。
本法具有快速简便的特点，一般7 d可观察结果。
2.3.2 受试菌株的制备将受试菌株转入液体培养基于37℃培养2周，吸取培养菌液少许，置于4 ml液体培养基中，加入直径2～3 mm无菌玻璃珠10～20粒，振荡20～30 s，静止沉淀10～20 min，吸取菌悬液上清，用液体培养基调整比浊至1个麦氏单位，相当于1mg/ml备用。
2.3.3 待检物的准备待检物采用两组共11个药物浓度，分别为(6.25，12.5，25，50，100 μg/ml)和(0.625，1.25，2.5，5，10，20μg/ml) 。称取适量待检药，用2%dmso溶解成母液，用液体培养基稀释成10倍终浓度的工作液。
检测时各取上述工作液20 μl加入170 μl液体培养基中，再加入1 mg/ml浓度的待检菌液10 μl，对照组不加药。37℃ 7 d孵育后，每孔加入mtt溶液(5 mg/ml)10 μl。然后再孵育过夜。如果加入mtt后，有紫色沉淀出现，就在有沉淀的孔中加入50 μl的sds-dmf溶液，再孵育3 h。如果颜色从黄色变为紫色即预示着细菌生长。检测结果见表1～3。表1～2显示当麦角甾醇过氧化物浓度超过20 μg/ml，结核分枝杆菌不生长，有抗结核活性。表3显示当7-脱氢胆甾醇过氧化物的浓度超过50 μg/ml时，结核分枝杆菌不生长，有抗结核活性。
注h37rv菌株, inh mic为0.125 μg/ml, rfp mic为0.03 μg/ml, sm mic为0,25 μg/ml, eb mic为0.5 μg/ml。表1 mtt法对不同浓度下麦角甾醇过氧化物的检测结果表2 mtt法对不同浓度下麦角甾醇过氧化物的检测结果表3 mtt法对不同浓度下7-脱氢胆甾醇过氧化物的检测结果
3 讨论
目前，临床上应用的抗结核药物因长期使用和不合理用药已经产生了严重的耐药现象，而且已经有很多报道证实，常用的一线药物对肝脏毒性较大。为此，寻找和开发新的抗结核药物是目前临床研究的重要课题，应用mtt快速显色法检测麦角甾醇过氧化物对结核分枝杆菌标准毒力株h37rv具有抑制作用，其mic为20 μg/ml。7-脱氢胆甾醇过氧化物对结核分枝杆菌标准毒力株h37rv同样具有抑制作用，其mic为50 μg/ml。本实验结果表明，有必要对分子结构中含共轭双键的萜类化合物进行进一步的系统研究，并开发新型的抗结核药物。
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[7] 陈国良,谭国良,孙平华.抗结核药物的研究与开发[j].药学进展,2004,28(12):534.
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