摘 要：目的：研究亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因多态性与自然流产的关系。方法：运用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性技术（PCR-RFLP）检测53例自然流产患者及63例正常对照组MTHFR C677T基因多态性，并加以对照分析。结果：自然流产组MTHFR基因TT纯合基因型、CT杂合基因型及T等位基因频率（分别为28.3%、47.17%、54.05%）均明显高于正常对照组（分别为19.05%、28.57%、32.20%），基因型和等位基因频率分布差异均有统计学意义（P＜0.05），T等位基因与自然流产的发生密切相关（OR=2.28，95%可信区间：1.24～4.26）。结论：基因C677T位碱基突变是自然流产发病的重要遗传因素，为探讨自然流产发病机理提供了新的依据。
关键词：自然流产；基因；亚甲基四氢叶酸还原酶
亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是同型半胱氨酸（Hcy）与叶酸代谢的关键酶。亚甲基四氢叶酸还原酶基因的突变会引起酶活性有所降低，结果使叶酸水平降低，DNA低甲基化得产生及血浆Hcy浓度的升高，导致一系列病理的改变引发多种疾病[1]。最新研究表明，不明原因的重复性自然流产与血液的高凝状态有关。检测了53例自然流产患者和63例健康人，运用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，探讨了（MTHFR）基因多态性与自然流产的相关性，为探索自然流产的发病机理提供资料。
1 资料与方法
1.1 一般资料：选取2009年1月～2011年1月期间在我院就诊的自然流产非孕期患者53例，年龄（28.4±2.5）岁，平均27岁，其中1次25例，2次18例，3次及以上10例。皆符合自然流产诊断标准[2]：排除生殖器解剖学畸形；外周血染色体异常；内分泌功能异常；对照组63例，均为非孕期正常妇女，年龄（26.9±2.8）岁，平均27岁，无相关病史。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。
1.2 研究方法：清晨空腹取外周静脉血4 ml，2%乙二胺四乙酸二钠（EDTA）抗凝，严格参照试剂盒说明，提取基因组DNA。利用RFLP可对其基因多态性进行检测。MTHFR C677T基因片段扩增及突变的检测PCR引物[3]：P1（NCO-351）：5′-GAAGCAGGGAGCTTTGAGGC-3′；P2（NCO-352）：5′-CCCATGTCGGTGCATGCCTT-3′。PCR反应体系总体积30 μl：10×Buffer 3 μl，4×dNTP 1.5 μl（2.5 mol/L），P1和P2各1 μl（6 pmol/L），Taq DNA聚合酶（Promega 1 U/μl）1.5 μl，模板DNA 5 μl（40 ng/μl）。94℃预变性5 min，然后进入循环程序：94℃ 45 s，72℃ 50 s，54℃ 30 s，共37个循环，75℃延伸15 min。2%琼脂糖凝胶电泳法检测扩增结果。6%聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳法检测突变结果。
1.3 统计学分析：运用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析，观察数据以均数±标准差（ ）表示，率的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
两组MTHFR基因型和等位基因频率分布：见表1。
表1 两组MTHFR基因型和等位基因频率分布[例（%）]
组别
例数
基因型频率
等位基因频率
TT
TC
CC
T
C
自然流产组
53
15（28.30）
25（47.17）
13（24.53）
40（54.05）
34（45.95）
正常对照组
63
12（19.05）
18（28.57）
33（52.38）
38（32.20）
80（67.97）
MTHFR C677T相关的基因型和等位基因频率比较：自然流产患者组基因型频率与正常组比较，差异有统计学意义（χ2=9.05，P＜0.05）；自然流产患者组等位基因频率与正常组比较，差异有统计学意义（χ2=5.42，P＜0.05）。总的突变T等位基因显著高于对照组（χ2=11.35，P＜0.05）。自然流产组MTHFR C677T基因型C/C、T/C、T/T基因型频率分布与正常对照组比较，差异有统计学意义（χ2=9.05，P＜0.05）。自然流产组T等位基因型频率为54.05%，亦与正常对照组者分布差异有统计学意义（χ2=11.35，P＜0.05），T等位基因与自然流产发生明显相关（OR=2.28），95%可信区间：1.24～4.26。3 讨论
重复性自然流产的病因至今尚不完全清楚，近几年研究者发现流产发生的一个重要原因与蜕膜绒毛缺血性坏死有关[4-5]。亚甲基四氢叶酸还原酶缺陷导致同型半胱氨酸向甲硫氨酸转化发生阻碍，导致同型胱氨酸血症。本文已确诊的自然流产患者与健康人进行对比分析，结果表明自然流产患者突变等位基因频率与纯合突变基因型频率均明显高于对照组，证明亚甲基四氢叶酸还原酶基因的多态性可能是自然流产的一个遗传风险因素，值得我们进一步研究。
4 参考文献
[1] Goyette P,Sumner JS,Milos R,et methylenetetrahy-drofolate reductase:Isolation of Cdna,mapping and mutation identification[J].Nature Genet,1994,7(2):195.
[2] 董素琴,杜欣莹,刘学云.MHHFR基因与不明原因习惯性流产的相关性分析[J].实用妇产科杂志,2006,22(8):500.
[3] 张家颖,左文静,武广恒,等.MTHFR基因C677T多态性与习惯性流产的关联性分析[J].吉林大学学报•医学版,2009,35(1):22.
[4] 白慧健,马太芳,李 钊,等.胚胎血红蛋白基因变异与自然流产的相关性研究[J].吉林医学,2011,32(36):7689.
[5] Goyette P,Frosst P,Darid SR,et novel mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene and genetype/phenotype correlations in severe methylenetetrahydrofolate reductase deficiency[J].Am J Hum Genet,1995,56(6):1052.
[收稿日期：2012-03-21 编校：苏建东]
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