桑黄多糖的提取及抗氧化性研究(黄酮超声提取工艺流程)

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【摘要】 目的： 研究超声法提取桑黄中总黄酮的最佳工艺。方法： 设计正交试验，采用超声辅助提取，对桑黄中总黄酮的提取工艺进行研究。结果： 以总黄酮提取率为指标，得出超声法提取桑黄总黄酮的最佳工艺为乙醇浓度70%，提取温度45℃，料液比1∶30，提取时间45 min。结论： 该工艺提取桑黄中总黄酮，方法简单，耗时短，提取率高。

【关键词】 桑黄; 总黄酮; 超声提取; 正交设计

research on the extraction of total flavonoids fromphellinus vaninii with ultrasonicassisted technique

　　xia guohua, ge yanru, fu haizhen, qi xueyong

　　(school of pharmacy, jiangsu university, zhenjiang jiangsu 212013, china)

　　[abstract] objective: the best extraction technique of total flavonoids from phellinus vaninii with ultrasonicassisted technique was s： the orthogonal design was used in the research on the ultrasonicassisted technique extraction technique. results： the optimum conditions of the extraction were as follows: ethanol 70%; extracting temp 45℃; the ratio of solid to liquid 1∶30; extracting time 45 min. conclusion： this process was featured by higher extraction rate and shorter extraction time.

　　[key words] phellinus vaninii; total flavonoids; ultrasonic; orthogonal design

　　桑黄属担子菌亚门、多孔菌科, 又称桑臣、桑耳、胡孙眼、孔菌等, 是一种珍贵的药用真菌，在我国传统中药中用于治疗痢疾、盗汗、血崩等[1]。目前主要应用于肝炎及癌症的治疗，其特有的抗肿瘤活性及低毒性使其成为研究热点[2,3]。桑黄主要化学成分为多糖和黄酮。现有的关于桑黄的文献报道中，提取桑黄总黄酮多采用乙醇浸提或回流提取，试验耗费时间长，且提取率不理想[4]。

　　本研究采用超声辅助提取，并对提取条件进行优化。

　　1 仪器与试剂

　　1.1 仪 器

　　kq250b型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);rotavapor r200旋转蒸发仪(德国buchi公司);fd1c50冷冻干燥机(北京博医康技术公司);uv2401型紫外分光光度仪(日本岛津公司)。

　　1.2 试 剂

　　芦丁标准品(南京泽朗，经高效液相色谱法检测纯度大于99%);桑黄子实体(phellinus vaninii，长白山区杨树野生桑黄，购自延吉长白山特产经营部，本院张朝辉教授鉴定);水为实验室自制去离子水，提取乙醇(广源医药，药用规格)，其余试剂为分析纯。

　　2 提取工艺

　　2.1 提取方案

　　准确称取60目桑黄子实体粉末15 g，加入一定体积的乙醇，室温下浸泡12 h后超声提取，残渣用相同浓度和体积的乙醇再超声提取一次，合并两次提取液，回收乙醇，浓缩液冷冻干燥，得到桑黄提取物。

　　2.2 黄酮的定性反应

　　2.2.1 盐酸-镁粉反应 少量提取物用乙醇溶解，加少许镁粉，浓盐酸3～4滴。加入镁粉前溶液呈暗黄色，滴加浓盐酸后有泡沫产生，且升腾的泡沫呈橙红色。

　　2.2.2 浓氨水反应 提取物乙醇溶液点在滤纸上，置于浓氨水上方30 s，紫外灯下观察，显黄色荧光斑点。

　　2.2.3 薄板层析 提取物乙醇溶液点于硅胶板上，展开剂(正丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶5)中展开，置于紫外灯下观察，显黄色荧光斑点。

　　2.3 uv法测定桑黄总黄酮的含量[5]

　　2.3.1 溶液的配制 准确称取芦丁标准品23.2 mg，用70%乙醇溶解并定容至50 ml，作为标准液备用。称取0.8 g硼酸和1.0 g乙酸钠，用70%乙醇溶解并定容至100 ml，作为络合试剂。

　　2.3.2 标准曲线 准确吸取标准芦丁溶液0.5,1.5,2.0,2.5,3.0 ml ,加70%乙醇定容至25 ml。分别精密吸取上述溶液5 ml，加5 ml络合试剂混匀后，384 nm处测光密度。

　　以光密度d为纵坐标，芦丁浓度c(μg·ml-1)为横坐标，绘制标准曲线，得芦丁浓度(c)与光密度(d)关系曲线的回归方程式：d=0.03c-0.0182，r2=0.9992。

　　2.4 正交试验

　　2.4.1 正交试验设计 选取乙醇浓度、提取温度、料液比和提取时间作为4个影响提取的因素，设计l9(34)的4因素3水平正交试验。如表1所示。表1 正交试验因素与水平表

　　2.4.2 总黄酮提取率 分别准确称取各提取条件下的提取物约17.3 mg，加70%乙醇定容至25 ml。精密吸取各样品液1.5 ml，加70%乙醇定容至25 ml。分别精密吸取5 ml与5 ml络合试剂充分混合，384 nm处分别测光密度，按照下列公式计算总黄酮提取率。

　　总黄酮提取率=提取物总黄酮黄酮量原药材量×100%

　　2.4.3 正交试验结果 以桑黄总黄酮提取率为指标，根据上述正交试验因素水平表，采用l9(34)来确定最佳提取条件，正交试验结果见表2。

　　由表2正交试验结果可以看出，影响总黄酮提取率的反应条件中各因素主次为b>c>a>d，即提取时间>料液比>乙醇浓度>提取温度;最优的提取工艺应为a2b2c3d2，即：乙醇浓度70%，料液比1∶30，提取温度为45℃，时间为45 min。表2 超声提取桑黄中总黄酮正交试验结果

　　2.5 验证试验

　　最优的提取工艺为a2b2c3d2，并未在正交试验中进行，需进行验证试验。准确称取15 g的桑黄子实体粉末，加入70%乙醇450 ml，室温下浸泡12 h后超声45 min，控制温度45℃，残渣以相同方法再超声提取一次，合并两次提取液，回收乙醇，浓缩液冷冻干燥后按“2.4.2”项下测得总黄酮含量为76.6%,提取率为7.07%，结果与正交结论一致。

　　最大料液比1∶30时并未出现提取效应的下降，因此对该条件进行验证，45℃时用70%乙醇提取45 min的条件，选取料液比1∶40与1∶50进行提取，测得其总黄酮提取率分别为6.44%与6.73%，与同等条件下料液比1∶30的验证试验相比没有提高，因此1∶30可认为是最佳料液比。2.6 加热回流提取

　　准确称取60目桑黄子实体粉末15 g，加入70%乙醇450 ml，室温下浸泡12 h后加热回流提取3 h，残渣加70%乙醇450 ml再回流提取3 h，合并两次提取液，回收乙醇，浓缩液冷冻干燥后按“2.4.2”项下测得总黄酮含量为33.0%,提取率为2.72%。

　　3 讨 论

　　相对于加热回流提取，超声辅助提取方法提高了桑黄总黄酮的提取率，缩短了提取时间，操作简单。

　　最优提取条件下总黄酮提取率高，但是其杂质含量也较高，可能会对进一步的分离纯化带来困难。

　　目前市场商品性 “桑黄”物种混乱，由于寄主不同、菌株来源不同等因素，其黄酮含量差异也较大，用上述工艺考察测定市面常见的几个品种，结果表明，杨树桑黄中总黄酮的含量最高，其次是白桦桑黄和黑桦桑黄，落叶松桑黄中含量最低。

【参考文献】
　　[1] 江苏新医学院. 中药大词典[m]. 上海：上海科学技术出版社，1995.

　　[2] shon yh, nam ks. inhibition of cytochrome p450 isozymes and ornithine decarboxylase activities by polysaccharides from soybeans fermented with phellinus igniarius or agrocybe cylindracea[j]. biotechnol lett, 2004，26(2)： 159-163.

　　[3] song ty, lin hc, yang nc, et. antiproliferative and antimetastatic effects of the ethanolic extract of phellinus igniarius(linnearus: fries) quelet[j]. j ethnopharmacol, 2008，115(1)：50-56.

　　[4] 宋 铂，周培根，王 艳，等. 利用大孔树脂吸附提取桑黄总黄酮[j]. 上海水产大学学报，2007，16(1)：60-63.

　　[5] 刘艳芳，杨 焱，贾 薇，等. 药用真菌桑黄总黄酮测定方法研究[j]. 食用菌学报，2006，13(2)：45-48.

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